ДНК-сегменты, амплификация

Рис. 21-26. Возможный механизм амплификации гена, приводящей к избыточной продукции белка Процесс начинается с акта дупликации, в основе которого, но-видимому, лежит незаконная рекомбинация. Изображенная на рисунке схема предполагает, что незаконная рекомбинация может быть следствием дестабилизирующего эффекта избыточной репликации ДНК. Если дупликация гена произошла, неравный обмен сестринских хроматид в результате рекомбинации между одинаковыми копиями генов в ходе репликации ДНК может дополнительно увеличить число копий гена (см. разд. 10.5.2) в результате их количество в хромосоме может достигать десятков и сотен. Многочисленные повторы ДНК делают видимым содержащий их сегмент — он выявляется в хромосоме как область гомогенного окрашивания. Амплифицированный участок может быть также вырезан из своего локуса (видимо, опять же с участием какого-то из рекомбинационных механизмов) и дать начало самостоятельным двойным минихромосомам (см. разд. 21.1.13). Общая длина амплифицированного по такому механизму сегмента ДНК обычно

Чтобы понять, как именно происходит амплификация определенного сегмента ДНК в ходе ПЦР, нужно четко представлять положение всех праймеров и комплементарных им последователь- [c.94]

Роль амплификации последовательностей ДНК в эволюции генома. Сходные последовательности в пределах одного генома в принципе могут возникать как независимо, так и при копировании исходной уникальной последовательности ДНК-после-довательности- родоначальника . Вероятность того, что две сходные последовательности возникли независимо, тем меньше, чем больше их сходство и длина. Нет сомнений, что именно увеличение числа предковых последовательностей привело к появлению семейств сходных последовательностей, которые составляют значительную часть современных геномов. Увеличение числа копий сегментов ДНК в ходе эволюции или в процессе эксперимента называется амплификацией. За амплификацию последовательностей в составе кластеров или последовательностей, рассеянных по новым геномным локусам, отвечают разные механизмы (гл. 10). Если основная последовательность удовлетворяет физиологические потребности организма, то образование дополнительных ее копий в геноме не приводит к особым преимуществам- подразумевается, что все эти копии, кроме одной, не содержат мутаций, включая нуклеотидные замены, делеции и вставки. Одна измененная копия может быть нефункциональной или выполнять какие-то новые функции либо служить регуляторным элементом. Если такие измененные последовательности окажутся полезными, то они сохранятся под давлением отбора. В противном случае эти последовательности следует отнести к псевдогенам. Таким образом, амплификация ДНК создает основу для эволюции. [c.159]

Многие геномные перестройки не запрограммированы, они не связаны с каким-то специфическим влиянием на экспрессию генов и в них есть э.темент случайности. Случайными могут быть частота таких событий, сами сегменты ДНК или то и другое. Примерами таких довольно редких событий служит транспозиция последовательностей ДНК из одного геномного локуса в другой или дупликация и последующая амплификация сегментов ДНК. Однако сходные транспозиции и амплификации могут быть сопряжены также с неслучайными, запрограммированными изменениями. Такие запрограммированные события играют ключевую роль в регуляции экспрессии некоторых генов во время дифференцировки и развития определенных типов клеток. [c.227]

В регуляции генной экспрессии в процессе развития иногда участвует запрограммированная амплификация специфических сегментов ДНК. Это четко показано для некоторых простейших, беспозвоночных и позвоночных. В каждом случае в результате амплификации в специфических клетках в определенный момент времени образуется огромное число генных копий, в результате чего синтезируется большое количество важного генного продукта. Однако молекулярные стратегии, используемые для амплификации в конкретных случаях, существенно различаются. [c.302]

Способностью к амплификации обладают короткие, менее 5 т. п. н., сегменты ДНК, расположенные в области хорионических генов в хромосомах [c.304]

A. ПЦР-амплификация участка (3-глобинового гена, содержащего сайты для эндонуклеазы vnl, один из которых отсутствует в мутантном гене. Б. Рестрикция полученных ПЦР-продуктов с помощью vnl. Нормальный ген содержит три vnl-сайта в сегменте ДНК, фланкируемом праймерами, а мутантный - два. [c.196]

Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК L- и Н-цепей из клеточной линии гибридомы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ПЦР. В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5 - и 3 -концов последовательность, кодирующую вариабельную область. Зная нуклеотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (V и Vjj), легко определить границы DR, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные области относительно консервативны. Исходя из данных о нуклеотидных последовательностях ДНК, кодирующих DR грызунов, синтезировали шесть пар олигонуклеотидных праймеров. Каждая пара инициировала синтез ДНК, кодирующей одну из шести DR грызунов три, локализованных на L-цепи, и три - на Н-цепи. Кроме того, на 5 -конце каждого праймера находилось 12 дополнительных нуклеоти- [c.217]

МИ, проводят гибридизацию in situ с комплементарными им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и проводят амплификацию СА-повтора. Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученной от большого числа индивидуумов. ПЦР-продукты, длина которых для удобства электрофоретического разделения выбирается примерно 200 п. н., разделяют в полиакриламидном геле. Если длина амплифицированного таким образом сегмента ДНК одинакова для всех образцов ДНК, значит, повтор не полиморфен (рис. 20.14, А), и наоборот, если образуются [c.455]

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (Polymerase hain rea tion) Метод амплификации специфического сегмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-поли-меразы с использованием олигонуклеотидных ДНК-зондов, комплементарных последовательностям противоположных цепей ДНК, фланкирующим амплифицируемый сегмент. Процесс состоит из серии циклически повторяющихся реакций денатурации ДНК, отжига зондов, синтеза ДНК. [c.557]

Дупликации генов обычно объясняют редкими событиями, которые катализируются некоторыми рекомбинационными ферментами. Однако у высших эукариот имеется эффективная ферментативная система, которая соединяет концы разорванной молекулы ДНК. Таким образом, дупликации (а также инверсии, делеции и транслокации сегментов ДНК) могут возникать у этих организмов вследствие ошибочного воссоединения фрагментов хромосомы, которая по каким-то причинам оказалась разорванной. Если дуплицированные последовательности соединяются голова к хвосту , то говорят о тандемных повторах. Появление одного тандемного повтора легко может привести к возникновению их длинной серии в результате неравного кроссинговера между двумя сестринскими хромосомами, поскольку длинные участки спаривающихся последовательностей представляют собой идеальный субстрат для обычной рекомбинации (рис. 10-63). Дупликация ДНК и следующий за ней неравный кроссинговер лежат в основе амплификации ДНК, процесса, который, как выяснилось, способствует возникновению раковых клеток (см. рис. 21-26). В ходе неравного кроссинговера число тандемно повторяющихся генов может как увеличиваться, так и уменьшаться (см. рис, 10-63). Большое количество повторяющихся генов будет поддерживаться естественным отбором лишь в том случае, если существование дополнительных копий окажется выгодным для организма. Как отмечалось выше, у позвоночных тандемный повтор кодирует большой предшественник рибосомной РНК, что необходимо для обеспечения потребности растущих клеток в новых рибосомах (см. разд. 9.4.16) Кластеры тандемно повторяющихся генов кодируют у позвоночных и другие структурные РНК, включая 58-рРНК, 111- и и2-мяРНК. Тандемные повторы характерны и для гистоновых генов, на которых синтезируется большое количество белка, требующегося в каждой 8-фазе. [c.237]

Явление амплификации сегментов хромосомной ДНК у актиномицетов может быть использовано для конструирования интегративных амплифицирующихся векторов, в которых чужеродный ген включается внутрь АП. [c.169]

Семейства поторяющихся последовательностей как нефункциональные структуры. В разд. 9.4.Г мы уже говорили о том, что некоторые геномные сегменты не выполняют никаких генетических функций. По-видимому, именно таковы псевдогены и процессированные гены. Если учесть, что многие диспергированные семейства содержат большое число таких генов, то можно сделать вывод о нефункционально-сти целых семейств. Такая ДНК получила название эгоистичной, поскольку вся ее деятельность направлена на собственные амплификацию и распространение в геноме. Возможные механизмы амплификации и распространения описаны в гл. 10. Здесь мы лишь отметим, что такие события отнюдь не безобидны распространение повторов в геноме может приводить к инсерционным мутациям в регуляторных или кодирующих последовательностях. Кроме того, множественные диспергированные повторы могут благоприятствовать делециям функциональных сегментов в результате гомологичной рекомбинации. Таким образом, ничем не органиченная эгоистичность может иметь катастрофические последствия для функциональной части генома. [c.206]

Циклы. Количество циклов, которое необходимо провести для амплификации требуемой последовательности, обратно пропорционально количеству копий матрицы в реакционной смеси. Обычно используют такое число копий, чтобы видимый продукт образовывался после проведения 25-50 циклов. Во время ПЦР наблюдается экспоненциальная фаза увеличения числа синтезированных молекул дцДНК, которая продолжается до тех пор, пока это число не достигнет -1012. Затем скорость накопления продукта резко уменьшается. Существует несколько основных факторов, которые препятствуют экспоненциальному накоплению продукта, как это должно происходить теоретически. Из них следует упомянуть истощение субстратов реакции (праймеров или НТРз), стабильность компонентов реакционной смеси, ингибирование ПЦР конечным продуктом реакции, конкуренцию за субстраты неспецифическими продуктами ПЦР или димерами праймеров, повторный отжиг продуктов ПЦР, препятствующий элонгации праймеров, неполную денатурацию в присутствии большого количества продукта ПЦР и ряд других. С учетом этих факторов из-за эффекта плато увеличение числа циклов само по себе не приводит к возрастанию специфичности ПЦР или накоплению специфического продукта. Для повышения специфичности ПЦР необходимо понижать число циклов и уменьшать продолжительность их отдельных сегментов (время денатурации, отжига и элонгации праймеров). Однако для повышения эффективности ПЦР при амплификации больших участков матрицы [c.202]

Природные источники V-генов иммуноглобулинов. При использовании природных источников последовательностей У-ге-нов имеется в виду, что сама иммунная система животных или человека создает требуемое разнообразие этих последовательностей, При таком подходе мРНК В-лимфоцитов доноров используют для получения кДНК с последующей амплификацией с помощью ПЦР соответствующих последовательностей. При этом как у человека, так и экспериментальных животных доноры могут быть двух типов предварительно иммунизированные (инфицированные) [246, 247] и не имевшие контакта с конкретным антигеном [248], Современные базы данных предоставляют полную информацию о всех последовательностях генов клеток зародышевой линии человека V , V , V , а также J- и D-сегментов [c.422]

Высказывалась интересная гипотеза о том, что соединение экзонов между собой при их амплификации и перемешивании происходит вследствие рекомбинаций в интронах, благодаря чему кодирующие участки генов остаются интактными. Эта гипотеза предполагает, что интроны являются древними структурами, которые присутствовали в самых ранних генах и клетках и были утрачены в ходе эволюции прокариот. Согласно другой гипотезе, интроны, напротив, представляют собой вставки (инсерции) в ранее существовавшие кодирующие области при помощи механизма, более присущего эукариотам, чем прокариотам. Правда, с инсерционной моделью связаны некоторые проблемы, не возникающие в том случае, если принимается гипотеза о древнем происхождении интронов. В частности, встает вопрос о том, каковы последствия мутаций, вызванных широко распространенными случайными вставками некодирующих сегментов ДНК, и вопрос о необходимости одновременной эволюции механизма сплайсинга. С другой стороны, если интроны присутствовали в самых ранних геномах, то и сплайсинг тоже должен быть очень древним процессом. Данные о том, что некоторые интроны катализи- [c.17]

Эволюция тандемных повторов, входящих в кодирующие последовате.шюсти. В этой главе мы уже приводили несколько примеров существования тандемных повторов внутри генов. В одних из них, таких как рДНК, разные кодирующие сегменты идентичны. В других, например в глобиновых генах и в кластере генов гормона роста человека/плацентарного лактогена, некоторые кодирующие сегменты относятся к разным генам. В общих чертах механизм образования тандемных повторов путем амплификации сегментов с последующей мутацией одной копии гена и отбором считается установлен- [c.195]

Морфологические изменения второго типа обнаруживаются в нормальных во всем остальном хромосомах и проявляются в атипичном характере исчерченности определенных областей при дифференциальном окрашивании (рис. 7.23) эти области называют гомогенно окрашивающимися (HSR). Как правило, они весьма протяженны, и хромосома, содержащая HSR, длиннее своего гомолога (рис. 10.88, ). В клетках, устойчивых к метотрексату, после гибридизации in situ с радиоактивным зондом, представляющим собой клонированный дигидрофолатредуктазный ген, и обработки фото-чувствительной эмульсией на HSR обнаруживаются зерна серебра. Таким образом, амплифицированные последовательности находятся внутри HSR. В хромосомах клеток сирийского хомячка, содержащих амплифицированные гены аспартат-карбамоил-трансферазы, также обнаруживаются лишние протяженные участки. Поскольку эти участки окрашиваются негомогенно, они не являются HSR, но тем не менее содержат амплифицированные сегменты ДНК (рис. 10.88, В). В некоторых случаях амплификация гена AD происходит и в нормальном локусе AD сирийского хомячка (в хромосоме В9р), хотя другие хромосомы тоже могут содержать много копий этого гена и иметь разнообразные аномалии (рис. 10.88, Г). Могут встречаться и двойные мини-хромосомы. Во всех исследованных случаях амплификация касается только одной пары гомологичных хромосом. В отличие от нестабильных амплифицированных генов в двойных мини-хромо- [c.309]

Любая модель амплификации должна учитывать следующие факты 1) амплификация может происходить в обычном локусе, в удаленных от него локусах и в независимых двойных мини-хромосомах 2) геномные сегменты, значительно превьина- [c.310]

Из всех этих моделей следует, в частности, что в месте соединения тандемно повторяющихся единиц появляется новый сегмент. Это не согласуется с амплификацией хорионического гена Drosophila, о которой шла речь в разд. 10.7.а в этом случае дополнительные копии ДНК не связаны ковалентно с остальным геномом и никаких новых сегментов не образуется. Новые последовательности в месте соединений обнаружены в AD-системе (рис. 10.90). Отметим, что они амплифицируются вместе с самой [c.311]

Возникновение и выявление тандемных повторов в ДНК на примере амплификации гена AD. А. Схема амплификации и образования нового рестрикционного фрагмента на месте соединения генов (Е1 ЕЗ- соР1-сайты). Б. Блот-гибридизация по Саузерну соР1-фрагментов ДНК из нормальных и С-клеток (табл. 10.6). В качестве зонда использовали фрагмент гена AD левее сайта Е2. В ДНК из нормальных клеток с зондом гибридизуется один сегмент (его длина 8.5 т. п. н.), присутствующий [c.313]

Химическая стимуляция амплификации. Имеются данные о том, что многие сегменты генома изредка подвергаются спонтанной случайной амплификации. Частота такой амплификации в культуре клеток (в отсутствие давления отбора) составляет не более 10 -на каждую амплифици-руемую единицу в одном клеточном поколении. Если учесть, что средняя длина амплифицируемой единицы составляет 10 п.н. и, таким образом, в геноме размером 10 п.н. содержится таких единиц и каждая из них может амплифицироваться, то большинство вновь образующихся клеток будут [c.314]

Смотреть страницы где упоминается термин ДНК-сегменты, амплификация: [c.89] [c.103] [c.194] [c.195] [c.218] [c.464] [c.176] [c.192] [c.199] [c.212] [c.239] [c.296] [c.184] [c.195] [c.227] [c.271] [c.303] [c.304] [c.304] [c.308] [c.311] [c.311] [c.311] [c.312] [c.313] [c.313]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология