Иммуноанализ гомогенные методы

Гомогенный анализ. Все описанные выше методы анализа предполагают отдельные измерения. Для непрерывного мониторинга биологически важных соединений с помощью биосенсоров необходимо, чтобы сигнал был непрерывным и непосредственно зависел от изменяющейся концентрации анализируемого вещества, не требуя предварительного разделения пробы. Недавно на основе двух совершенно различных явлений были разработаны гомогенные методы иммуноанализа. [c.498]

Подход (i использованием систем с переносом энергии только начинает разрабатываться в иммуноанализе и, безусловно, найдет применение как один из вариантов гомогенных методов иммуноанализа. [c.145]

Некоторые аспекты иммуноанализа требуют дополнительных комментариев. На чувствительность анализа неблагоприятно влияет противодавление, обусловленное введением образцов. По-видимому, оно связано с тем, что реагент 1 обладает повышенной вязкостью из-за присутствия полиэтиленгликоля. При использовании обводного потока для инъекции или модифицированной системы прокачивания точность измерений может значительно возрасти. Вероятно, чувствительность метода может увеличиться при работе с более сложной оптической системой. Характеристики анализа улучшатся благодаря применению моноклональных антител, а стабильность окрашивания возрастет при обеспечении лучших условий для ферментативной индикаторной реакции. Однако даже и без этих усовершенствований рассмотренная здесь система иллюстрирует эффективность нового подхода к разработке гомогенных методов ИФА. [c.168]

Потенциальные преимущества использования СВО-устройств в иммуноанализе обусловлены главным образом тем, что они позволяют с высокой чувствительностью контролировать поверхностные реакции. Обычные (см. например [21]) методики иммуноанализа являются многостадийными, включают несколько инкубаций и отделение связанных с антителами компонентов от несвязанных перед измерением сигнала, характеризующего связывание антител с антигенами. Стадия предварительного разделения является основным источником погрешности анализа, громоздка и явно требует какого-то технического решения. На создание методов иммуноанализа без разделения (т. е. гомогенных методов) было нацелено довольно много исследований. В результате были созданы такие методы, как иммуноанализ с поляризацией флуорес- [c.519]

Метод гомогенного ИФА без использования твердой фазы основан на различии каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунном комплексе. В настоящее время тер >ган гомогенный иммуноанализ применяют к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и регистрация глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе. [c.115]

Определение IgG человека (рис. 8-11) хорошо иллюстрирует возможности гомогенного иммуноанализа на основе ферментных каналов — удобного и чувствительного метода, не требующего разделения компонентов. Однако ограничения, связанные с практическим осуществлением анализа, не позволяют использовать его в клинике. В частности, необходимость применения крупных гранул для обеспечения высокой эффективности ферментного канала противоречит требованию о добавлении постоянного количества агарозного реагента, поскольку в случае крупных гранул удовлетворить этому требованию трудно. [c.117]

Недостатки гомогенного метода ЛИКА — это недостатки, присущие любому гомогенному варианту иммуноанализа. К ним следует прежде всего отнести влияние на результат анализа эндогенных примесей в образце и в самих реагентах. Использование АТР и NAD в качестве маркера требует удаления примесей этих кофакторов из препаратов антител (иммунных сывороток) и из образца. Для удаления АТР может быть использована обработка образца биологической жидкости раствором NalO в течение 10—15 мин, [c.128]

Известно, что радиус Стокса молекул IgG с Л г=150 000 составляет около 4 нм, а расстояние до активных центров около 5,5 нм. Таким образом, если на поверхности белковой глобулы расположить 4—12 молекул флуоресцеина, то среди них найдется по крайней мере одна, которая будет акцептором энергии молекулы донора, связанной с активным центром антитела. Для того чтобы эффект переноса энергии между IgG и флуоресцеином наблюдался в растворе, необходимо, чтобы концентрация флуорохро-ма была не ниже, чем 1—10 мМ. Если принять во внимание, что концентрация антител при проведении иммуноанализа составляет 0,01 пмоль, то очевидно, что перенос энергии может наблюдаться только внутри комплекса антиген — антитело и отсутствует между несвязанными молекулами. Этот факт положен в основу гомогенных методов иммуноанализа, базирующихся на эффекте переноса энергии. [c.144]

Альтернативный путь для разработки гомогенных методов иммуноанализа был предложен нами и другими исследовательскими группами. Этот подход, который мы первоначально назвали иммуноанализом на непрерывной поверхности [7], основан на контроле протекания реакции антиген-антитело после и (или) во время связывания с непрерывной поверхностью, которая является частью системы обнаружения сигнала. Принцип действия этих иммуносенсоров включает иммобилизацию одного из иммунореагентов на поверхности сенсора, которая изготовлена таким образом, что она приобрела чувствительность к некоторым компонентам или продуктам реакции. Для обнаружения иммунологических реакций на непрерывной поверхности использовались как электрохимические, так и оптические методы. Электрохимические методы описаны в гл. 15. В нашем обзоре внимание сконцентрировано на оптических системах, и в частности на использовании явления < полного внутреннего отражения в гомогенных методах иммуноанализа. [c.238]

Использование ФЗМ в иммуноанализе дает следующие преимущества 1) устойчивость меченых соединений при длительном хранении период полуинактивации ФЗМ при 4 С, как правило, превышает шесть месяцев 2) возможность быстрого определения концентрации ФЗМ при помощи общедоступных приборов, имеющихся в большинстве аналитических лабораторий 3) отсутствие радиационной опасности 4) возможность разработки легко поддающихся автоматизации скоростных методов иммуноанализа без разделения компонентов (гомогенных методов) 5) создание качественных визуальных тестов для массового контроля 6) усиление сигнала детектирования при использовании некоторых ФЗМ в методах с разделением компонентов (гетерогенных методах). [c.11]

В 1972 г. Рубенштейн с сотр. (К. Е. Rubenstein et al., 1972) разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в имму-нохимическом комплексе. В дальнейшем термин гомогенный иммуноанализ стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе. [c.7]

Использование метода ЛИКА на основе светляковой люциферазы в существенной мере ограничено труднодоступностью самого препарата фермента. В этой связи большой интерес представляют исследования по генной инженерии люциферазы светляков. Разработка и внедрение новой технологии прлучения препарата люциферазы с субстратной специфичностью к АТР обеспечит возможность широкого практического использования этой высокочувстви-тельной гомогенной модификации иммуноанализа. [c.129]

Описан новый гомогенный флуоресцентный метод иммуноанализа, построенный по бесконкурентному принципу с использованием одноточечной системы детектирования и автоматической проточно-инжекционной системы. Пероксидаза хрена, конъюгированная с антителами против IgG человека, катализирует окисление ЛДАДХФ (лейкодиацетилдихлорфлуоресцеи- [c.169]

В основе гомогенного хемилюминесцентного иммуноанализа стероидов лежит эффект усиления интенсивности хетилюминес-ценции при взаимодействии конъюгата стероид — изолюминол с антителами. Введение в эту систему свободного стероида ингибирует излучение, которое пропорционально концентрации добавленного стероида. Указанный принцип использован при разработке методов определения прогестерона, эстриол-16-глюкоронида, эст-риола. Несмотря на то что чувствительность этих методов сопоставима с РИА (5—10 мг), в ряде случаев собственная неспецифическая хемилюминесценция образца (плазмы или мочи) ограничивает возможности метода, затрудняет определение низких концентраций. [c.142]

В настоящее время 30% всех иммуноанализов в США включают применение изотопных меток. Остальные 70% выполняются в основном с помощью методов, в которых роль меток выполняют флуорофоры или ферменты. Применение нефелометрии ограничено анализом иммунных белков. Инфекционные заболевания в основном диагностируют с помощью гетерогенных методов с применением ферментных меток и бусин в качестве носителей, хотя 30% анализов выполняются с помощью более дешевых методик типа РИА. Контроль лекарственных препаратов осуществляют с помощью гомогенных методик, включающих применение ферментных меток или регистрацию поляризации флуоресценции. В случае анализа гормонов имеется большой выбор как гомогенных, так и гетерогенных методик с радиоактивными, ферментными и флуоресцентными метками. Доля неизотопных методов составляет 65% и имеет тенденцию к росту. Альтернативные методы йммуноана-лиза часто используются внутри определенной диагностической группы, например в анализах на тиреоидный статус. В США наиболее важным фактором является стоимость анализа, а различные технические аспекты обычно имеют второстепенное значение. В частности, 50% инструментального парка, используемого в иммуноанализе, работает с промышленно выпускаемыми реагентами. [c.19]

Фермент-зависимые метки (ФЗМ) — универсальные и чувствительные метки для иммуноанализа. Они отличаются продолжительным периодом полуинактивации, не создают радиационной опасности и позволяют проводить, иммуноферментный анализ (ИФА) без разделения компонентов (гомогенный анализ). ИФА без разделения требует меньше манипуляций и легче поддается автоматизации. Однако на нынешнем этапе своего развития этот метод недостаточно чувствителен. В то же время ИФА с разделением компонентов (гетерогенный анализ) обладает высокой чувствительностью и дает возможность определять два различных вещества одновременно. Превосходным примером высокой чувствительности ИФА с разделением компонентов служит метод определения ферритина, позволяющий измерять 0,2 аттомоль, т. е. 2-10 моль вещества (Ishikawa et al., 1982). [c.32]

Иммуноферментный анализ с применением в качестве метки простетических групп (ИФАПГ) представляет собой метод иммуноанализа без разделения компонентов (т. е. гомогенного анализа). Метод основан на 1) способности прочного ковалентного конъюгата [лиганд—простетическая группа] активировать апофермент, который сам по себе не проявляет ферментативной активности 2) способности антител против лиганда соединяться с конъюгатом [лиганд—простетическая группа], лишая его возможности активировать апофермент. [c.69]

В описанном Хайнеманом и др. [8] методе гомогенного иммуноанализа антиген эстриол метят ацетатом ртути и проводят его конкурентное связывание с антителом. Отделения свободного эстриола от связанного не требуется, поскольку в используемом диапазоне потенциалов эстриол неэлектроактивен. Более того, связанный с антителом меченый антиген восстанавливается при более отрицательном потенциале, чем свободный. Меченный ртутью эстриол восстанавливается при — 300 мВ (отн. н. к. э.) чтобы избежать мешающего влияния кислорода, пробы необходимо тщательно дегазировать. В противном случае при низких концентрациях антигена чувствительность определения снизится. В следующей работе группы Хайнемана [16] с эстриолом как модельной системой электроактивность эстриола изменяли нитрованием. При нитровании эстриола в положения 2 и 4 он становится электроактивным и характеризуется волнами восстановления при — 422 и — 481 мВ относительно хлоридсеребряного электрода сравнения. Это соединение авторы и использовали в гомогенном иммуно- [c.60]