Участок ori гибридный

Если теперь третий атом попадает в промежуток между двумя направленными гибридными орбиталями, то он не встретит на своем пути участок с достаточно большой электронной плотностью связь в этом направлении образоваться не может (рис 121) [c.62]

Из приведенной достаточно сложной схемы видно, что на протяжении функционирования происходят нетривиальные события. Так, иа первой фазе идет-образование гибридного дуплекса участка R—Us. Если бы в момент обратной транскрипции участка R Us в работу одновременно включилась активность РНКазы Н, мог бы деградировать еще не прочитанный участок геномной РНК и процесс был бы нарушен. Разрешение на включение РНКазы Н должно даваться только по завершении обратной транскрипции на 5 -конце геномной РНК. Нетривиальным событием является скачок, совершаемый геномной РНК после освобождения фрагмента ДНК от РНК. Важным и нетривиальным событием является последующий разрыв геномной РНК в определенной точке перед фрагментом U3, чем задает ся структура длинного концевого повтора. Опять- аки нетрудно заметить, что вопрос о переключении активностей в пределах одного работающего фермента также требует рассмотрения с позиций молекулярной динамики. [c.227]

Иногда понятия "генная инженерия" и "биотехнология" отождествляются (А А Баев, 1984), хотя несомненно генная инженерия представляет собой один из методов науки биотехнология В основу генноинженерных методов заложена способность ферментов — рестриктаз расщеплять ДНК на отдельные нуклеотидные последовательности, которые могут быть использованы для встраивания их в геномы бактериальных плазмид и фагов с целью получения гибридных, или химерных форм, состоящих из собственной ДНК и дополнительных встроенных фрагментов несвойственной им ДНК Поэтому методами генетической инженерии добиваются клонирования генов, когда выделяют нужный отрезок ДНК из какого-либо биообъекта и затем получают любое количество его, выращивая колонии генетически идентичных клеток, содержащих заданный участок ДНК Другими словами клонирование ДНК — это получение ее генетически идентичных копий [c.179]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

По мере того как происходит расплетение цепей ДНК, каждая из раздельных цепей взаимодействует с определенным участком фермента. Как показано на рис. 10.3, одноцепочечный участок матрицы, расположенный перед точкой присоединения первых рибонуклеотидов цепи РНК, будет находиться в свободном состоянии, а в том месте, где только что прошел синтез РНК, он будет существовать в форме гибрида ДНК—РНК. Таким образом, протяженность гибридной области может быть несколько меньше, чем расплетенный участок ДНК. Видимо, гибридный комплекс ДНК—РНК имеет в длину 12 пар нуклеотидов. [c.135]

Другой метод состоит во встраивании кодирующей последовательности в участок, находящийся непосредственно за местом начала синтеза бактериального белка. В результате образуется гибридный белок с N-концевой областью, соответствующей бактериальному белку, последовательность которого была прервана, и остальной частью белка, соответствующей встроенной чужеродной ДНК. N-концевая бактериальная последовательность может быть очень короткой и полезной. Например, она может представлять собой сигнальную последовательность, обеспечивающую секрецию гибридного белка в окружающую среду она может также служить для защиты гибридного белка от деградации в бактериальной клетке. [c.245]

Генетические и в особенности генно-инженерные методы позволяют соединить участок ДНК, несущий регуляторную область и сигнальную последовательность одного белка, с участком ДНК, кодирующими аминокислотную последовательность другого белка. В результате в клетке синтезируется гибридный или химерный белок. Такого рода эксперименты показали, что различные сигнальные последовательности эукариот и прокариот обычно взаимозаменяемы и обеспечивают выведение из цитоплазмы экспортируемых белков. Однако если второй белок в норме является цитоплазматическим, то экспорт его чаще всего не происходит. Иногда это связано с тем, что такие белки содержат внутренние участки, которые напоминают стоп-трансферные последовательности и поэтому застревают в мембране. Кроме того, у прокариот, где экспорт не сопряжен строго с трансляцией, может иметь значение неспособность образующихся химерных молекул принять конформацию, необходимую для последующей их транслокации из цитоплазмы. [c.67]

Маркерный пептид (Marker peptid) Участок гибридной белковой молекулы, облегчающий идентификацию или очистку белка. [c.553]

Последовательность оснований длиной 6 — 8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУГ у Е. соИ, определяет эффективность процесса трансляции. Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой, и его сдвиг в ту или иную сторону способен уменьшать эффективность трансляции мРНК. По имени исследователей, идентифицировавших этот участок, он был назван последовательностью Шайн-Дальгарно. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодоном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-концевых аминокислотных остатков происходят от источника регуляторных элементов и инициирующего кодона прокариотического гена. Такие гибридные белки часто более стабильны обработка их химическим или ферментативным способом приводит к вьщелению эукариотической части белка. [c.123]

Результаты эксперимента Бонгоффера и Гирера приведены на фиг. 97. Во-первых, видно, что два типа меченной Н ДНК, легкая и гибридная, четко разделяются в градиенте плотности s l. Во-вторых, можно видеть, что во время кратковременного включения С-БУ, продолжающегося 2,5 и 5 мин, которые составляют соответственно 0,0025 и 0,005 части от 1000-минутного времени генерации при 23 °С, плотность молекул ДНК, содержащих С-БУ, занимает промежуточное положение между плотностью легких и гибридных молекул ДНК. Следовательно, одна из цепей этих молекул содержит только тимин, а другая — как тимин, так и БУ. Однако, если включение С-БУ продолжается в течение 10 мин, молекулы ДНК достигают плотности, близкой к плотности гибридной ДНК. Таким образом, после ассимиляции БУ в течение / = 0,01 времени генерации двойные спирали имеют одну цепь, содержащую только тимин, и другую цепь, содержащую преимущественно БУ, т. е. к этому моменту молекулы ДНК почти полностью завершили репликацию. Так как средняя молекулярная масса ДНК в этих экстрактах составляет примерно 1% массы ядра бактерии (х = 0,01), то, следовательно, п = fix = = 0,01/0,01 = 1. Другими словами, по-видимому, в единицу времени реплицируется только один участок бактериальной ДНК, или имеется только одна реплицирующаяся Y-вилка на ядро. [c.201]

Профаг X почти всегда вырезается из хромосомы бактерии точно по своим границам, образуя кольцевую форму интактного генома X. Иногда, однако, вырезание происходит неточно, что приводит к образованию кольцевой молекулы ДНК, в которой один из концевых участков генома профага утрачен, а вместо него включен участок хромосомы Е. соИ, смежный с другим концом генома профага (рис. 7.9). Такие гибридные молекулы могут продуцировать новые жизнеспособные фа- [c.209]

Вестерн-блот-анализ гибридного белка Gal.T.HA, при котором в качестве зонда использовались моноклональные антитела к большому Т-антигену, показал, что гибридный белок подвергался деградации по всей длине. Например, антитело РАЬ423 (рис. 6.3), узнающее эпитоп, расположенный в С-концевом участке большого Т-антигена, связывается только с полосой на электрофореграмме, соответствующей белку с самой большой молекулярной массой, т. е. полноразмерным гибридным белком. Антитело РАЬ204, узнающее эпитоп, занимающий участок между аминокислотами 453 и 469 [5], взаимодействует с разными полосами, которые соответствуют как полноразмерным белковым продуктам, так и полипептидам с меньшей молекулярной массой, чем -галактозидаза. [c.178]

Рис. 6.8. Специфическая локализация гибридных белков САТ-8У-40 после трансфекции клеток МШЗТЗ рекомбинантными конструкциями на основе челночных векторов. А. Реакция гибридного белка САТ-фрагмент большого Т-антигена (аминокислоты —271) с моноклональными антителами, узнающими К-концевой участок Т-антигена, демонстрирует, что гибридный белок локализуется в ядре. Б. Реакция гибридного белка САТ-фрагмент малого 1-антигена (аминокислоты 1—174) с моноклональными антителами, узнающими уникальный участок последовательности 1-антиге-на, демонстрирует, что гибридный белок локализуется в цитоплазме. Для выявления связывания антител с гибридными белками использовалась пероксидазная система иммунодетекции (как описано в табл. 6.7).

E. Remaut et al., 1983). Авторы использовали фрагмент ДНК, кодирующий зрелый интерферон , соединенный с гибридной экспрессирующей областью, содержащей левый промотор фага X, —Pl и участок связывания рибосом гена репликазы фага MS2. Объединенная конструкция была встроена в плазмиду olEl-типа, и последняя введена путем трансформации в штаммы Е. соИ, несущие в геноме дефектный профаг с ts-репрессором X. Таким образом получена регулируемая система. При 28°С, когда репрессор функционирует, синтез интерферона не происходит, культура накапливает биомассу. Через 3 ч после индукции при 42°С количество -интерферона составляет 2% от суммарного белка (около 10 молекул на клетку). Принцип применения регулируемых промоторов может оказаться очень полезным во многих других случаях. [c.196]

Рис. 1. Метод РНКазного расщепления. Равномерно меченный одноцепочечный РНК-зонд транскрибируется с клонированной ДНК-матрицы. Зонд смешивают с двухцепочечным тестируемым фрагментом клонированной (геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК, и смесь нагревают для разделения цепей. Проводят отжиг РНК-зонда с комплементарной ему последовательностью в тестируемой ДНК и получают гибридные дуплексы. Если во фрагменте ДНК имеется единичная нуклеотидная замена, то в гибриде РНК—ДНК окажется однонуклеотидный неспаренный участок. Реассоцнированный образец обрабатывают РНКазой А, которая расщепляет цепь РНК по неспаренным участкам. Отметим также, что РНКаза А удаляет выступающие 3 - н 5 концы дуплекса. Дуплекс обрабатывают денатурирующими веществами для разделения цепей, затем проводят электрофорез в денатурирующем (сиквенсном) геле и фрагменты РНК фракционируют по размеру. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Если в тестируемой ДНК нет мутаций, на радиоавтографе наблюдается одна полоса, соответствующая по размеру длине

Рис. 4. Выявление единичных нуклеотидных замен методом ДГГЭ. Меченый одноцепочечный ДНК- или РНК-зонд смешивают с двухцепочечной (клонированной, геномной или амплифицированной в ПЦР) ДНК смесь нагревают для разделения цепей. Происходит отжиг зонда с комплементарной ему цепью тестируемого фрагмента, при этом образуются гибридные дуплексы. Если в исследуемом образце имеется мутация, то в гибриде будет однонуклеотидный неспаренный участок. После отжига к смеси добавляют избыток одноцепочечной кольцевой ДНК, комплементарной зонду, для удаления его остатков. Проводят электрофорез смеси в денатурирующем градиентном геле. Гель высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Наличие неспаренных участков в мутантных образцах ДНК, изменяющих характер плавления, приводит к тому, что эти фрагменты оказываются в геле ближе к старту вследствие пониженной термостабильности. Преимущество такого метода разделения мо- чекул с неспаренными участками в его повышенной разрешающей способности.

Таким образом, получаются либо две нерекомбинантные по фланговым маркерам молекулы (А—С и а—с), несущие гибридный участок — зону гетеродуплекса в районе среднего маркера В/Ь (рис. 7.11,Б), либо две молекулы, рекомбинантные по фланговым маркерам, и опять же гетеродуплексные в районе среднего маркера (рис. 7.11,Б ). [c.162]

НО, ЧТО средняя часть генома л не существенна для его литического размножения в Е. oli и может быть заменена на чужеродный фрагмент ДНК. Если размеры получаемой при этом ДНК не превышают предела (не более чем на 10 %), допустимого для упаковки в частицу фага, то образуются фаги с чужеродными фрагментами ДНК. В этом случае клонируемый участок ДНК хранят в виде частиц бактериофг(га или в виде клона бактерии с интегрированными гибридными профагами. Существует множество типов векторов, сконструированных на основе различных плазмид и различных бактериофагов. [c.274]

Еще один вариант решения задачи освобождения от неспецифических продуктов ПЦР предполагает создание матричной последовательности, комплементарной адаптеру, на цепи ДНК, которая синтезируется с праймера, комплементарного известной последовательности (рис. 26, д). При реализации этого принципа концы фрагментов ДНК лигируют с дефосфорилированным адаптером, что предотвращает объединение молекул адаптера друг с другом. Кроме того, адаптер содержит короткий двухцепочечный АТ-богатый участок. По завершении лигирования образовавшиеся молекулы гибридной двухцепочечной ДНК денатурируют и отжигают с праймером, комплементарным известной последовательности анализируемой ДНК, после чего этот праймер используют в качестве затравки для синтеза комплементарной цепи ДНК, на которой создается сайт посадки для встречного универсального праймера, расположенный в адаптере. Далее, в присутствии универсального и специфического праймеров проводят амплификацию исследуемого участка ДНК. По-другому решается та же самая задача методом пузырьковой ПЦР (bubble P R) (рис. 26, е) [312]. Здесь анализируемые фрагменты ДНК лигируют с адаптером, содержащим в центральной части некомплементарные друг другу последовательности аиЬ,из которых Ь идентична последовательности универсального праймера. Свое название метод получил из-за того, что некомплементарные одноцепочечные участки формируют структуру, напоминающую вздутие или пузырек. После лигирования, денатурации и отжига специфического праймера с достраивают комплементарную цепь, которая содержит сайт посадки универсального праймера, после чего амплифицируют анализируемый участок ДНК в присутствии двух праймеров Ь и с. [c.236]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология