Зональный электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез проводят либо в свободной незакрепленной среде (в свободной жидкости) — фронтальный электрофорез, либо в закрепленной среде — зональный электрофорез — на крупнопористых носителях (фильтровальная бумага, целлюлоза, порошкообразная пластмасса, агар-агар, ацетилцеллюлоза, стеклянный порошок) или на мелкопористых носителях (силикагель, полиакриламидный гель, целлюлоза, оксид алюминия, крахмал и др.). [c.237]

ЗОНАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [20,21] [c.84]

Область применения электрофоретическое фракционирование белков. Зональный электрофорез в полиакриламидном геле являет- [c.84]

На рис. 9 изображен прибор для зонального электрофореза в градиенте плотности [985]. Основной его частью является J-образная трубка, основание которой заполнено пробкой из полиакриламидного геля. В коротком колене трубки над пробкой геля находится насыщенный раствор хлористого натрия, в который погружен один из электродов. В длинном колене поверх трубки помещают слой забуференного насыщенного раствора сахарозы, а остальную часть этого колена используют как градиентную колонку. Для ее заполнения и опорожнения служит поршень, соединенный с градиентным смесителем или коллектором фракций при помощи гибкого пластмассового шланга. Кроме того, в поршне просверлены отверстия, которые заполняют забуференным полиакриламидным или агарозным гелем для обеспечения электрического контакта с на- [c.30]

Рис. 6.5. Электрофорез структурных белков очищенных вирионов вируса гриппа А в полиакриламидном геле. Вирус чумы птиц (штамм Добсон) был очищен зональным цен-

Анализ полученных препаратов фермента методом зонального электрофореза в полиакриламидном геле обнаруживает единственную отчетливую белковую полосу. [c.13]

Существуют два различных метода электрофореза фронтальный электрофорез, который проводят в свободной незакрепленной среде, и зональный электрофорез — в закрепленной среде (стабилизированная жидкость или носители). Они имеют единую аппаратурную схему источник тока, камеру для электрофореза, два электрода, соединяющих камеру с источником тока, и аппаратуру для сбора и идентификации разделенных веществ. Для электрофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофореза в полиакриламидном геле венгерской фирмы Реанал ), так и наборы, составляемые экспериментатором из отдельных приборов (универсальный источник питания УИП-1, двухлучевой регистрирующий микрофотометр ИФО-451 и др.). [c.144]

Поддерживающей средой для электрофореза могут служить фильтровальная бумага, крахмальный или агаровый гели, аце-тат-целлюлозная мембрана, полиакриламидный гель и т. д. Создаваемое в смоченной буферным раствором поддерживающей среде электрическое поле заставляет различные компоненты смеси белков двигаться в определенном направлении со скоростью, соответствующей заряду молекул, что приводит к их разделению. Если электрофорез происходит в крахмальном или полиакриламидном геле, то разделение зависит не только от заряда, но и от величины и формы молекул, так как в этом случае поддерживающая среда выполняет роль молекулярного сита. При электрофорезе в щелочном буферном растворе белки сыворотки крови разделяются по меньшей мере на 5 фракций. При ионной силе 0,1 и pH 8—9 быстрее всех к аноду движется альбумин. За ним следуют в порядке уменьшения скорости миграции а-1-, а-2-, р- и 7-глобулиновые фракции. Подбирая соответствующую поддерживающую среду и буферный раствор, можно улучшить разделение. Поэтому даже в сравнительно малооснащенной больничной или клинической лаборатории зональный электрофорез позволяет проанализировать белки более детально, чем свободный. [c.10]

Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций [1 ]. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этом увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом. [c.11]

Более практичным и эф- Поп проницаеыые мембраны фективным оказался, однако, электрофорез с применением тех или иных опорных сред, так называемый зональный электрофорез, т. е. электрофорез в растворах, которыми пропитывается какой-либо твердый пористый или порошкообразный носитель — фильтровальная бумага, крахмал, целлюлоза, стеклянный порошок и др. Еще более эффективным, хотя и менее удобным для препаративных целей, оказалось электрофоретическое разделение в гелях — агар-агаровом, крахмальном, полиакриламидном. [c.31]

Существует три типа электрофоретических систем электрофорез по Тизелиусу (с подвижной границей) зональный электрофорез (например, в среде с капиллярной структурой) стационарный электрофорез (изоэлектрическое фокусирование, изотахофорез). В медицинской и фармацевтической практике чаще применяется зональный электрофорез на фильтровальной бумаге, пленке из ацетатцел-люлозы, агаровом, агарозном, крахмальном или полиакриламидном гелях. Электрофорез белков сыворотки крови ведут в буферной среде с pH 8,6, когда молекулы белка и липопротеинов заряжаются отрицательно и движутся к аноду. После заверщения электрофоретического разделения электрофореграммы фиксируются и окрашиваются. Затем производят визуальную и денситометрическую оценку разделения белков. Для окраски различных белков на электрофоре-граммах используют специальные красители, часть из которых представлена в табл. 5. [c.44]

Как уже отмечалось, качество разделения при проведении электрофореза в градиенте плотности сахарозы зависит от толщины стартовой зоны, которая в свою очередь определяется конструкцией аппарата и способом введения пробы. Однако даже в идеальных условиях стартовая зона, как правило, составляет несколько миллиметров, и в целях повышения разрешающей силы электрофореза ее желательно уменьшить. Принцип диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет создавать очень тонкие стартовые зоны путем концентрирования белков, находящихся в исследуемом растворе. Именно поэтому он дает более эффективное разделение по сравнению с зональным электрофорезом в градиенте плотности. С другой стороны, извлечение белков из узких зон в полиакриламидном геле сложнее, чем из растворов с градиентом плотности. Процедура, сочетающая преимущества обоих методов, позволяет получать узкие стартовые зоны и легко выделять разделившиеся вещества из градиента плотности. Шастер и Шрир [1150] описали очень простой прибор для практического воплощения этой идеи. Электрофорез проводили в U-образной трубке. В обоих ее коленах над колонкой с градиентом плотности помещали слой полиакриламидного геля. Зоны, разделенные в геле, мигрировали затем в градиент плотности, где расширялись не более чем в 2—3 раза по сравнению с их толщиной в геле. Эта установка отличается довольно большой емкостью за один прием авторам удалось разделить 50 мг бычьего сывороточного альбумина, и, по их мнению, емкость должна быть еще больше при разделении более сложной смеси белков. [c.32]

Самый простой способ обеспечения стабильности электрофоретических зон заключается в том, что в среду для электрофореза вводят вещества, образующие капиллярную структуру. Ан-тиконвекционные свойства такой системы весьма высоки, если площадь поперечного сечения капилляров достаточно мала, так как в канале круглого сечения скорость потока снижается пропорционально четвертой степени радиуса. В качестве поддерживающей среды чаще всего используются фильтровальная бумага, пленки из ацетата целлюлозы, колонки или блоки целлюлозного порошка, гранулированный крахмал или гранулы поливиниловых полимеров, а также агаровый, агарозный, крахмальный или полиакриламидный гели. Зональный электрофорез в поддерживающей среде имеет ряд важных преимуществ. При его проведении можно использовать какой-либо простой и сравнительно недорогой прибор и анализировать одновременно несколько различных препаратов. Процедуры визуализации зон и выделения фракций осуществляются довольно легко. Вещества, обладающие биологической активностью, можно выявить непосредственно на электрофореграммах. Метод легко приспособить как для крупномасштабного разделения веществ, так и для микроразделения. Удается достигнуть очень высокой разрешающей силы, особенно в среде, характеризующейся одновременно антикон векционными свойствами и эффектом молекулярного сита. [c.34]

Набор белковых фракций, разделенных при электрофорезе, называется электрофореграммой , как синонимы применяются термины протеинограмма , белковый спектр электрофоре-граммы после двумерного электрофореза обозначают как белковые карты . С внедрением в микробиологические исследования новых модификаций зонального электрофореза, в частности в крахмальном и полиакриламидном геле, создалась возможность широкого изучения белков, свободных и связанных с субклеточными структурами бактерий разных систематических групп. [c.75]

Эти проблемы можно свести к минимуму при зональном электрофорезе, где (как и в методе зонального центрифугирования) макромолекулы присутствуют вначале лищь в очень тонком слое. Конвекцию можно подавить с помощью градиента плотности, но гораздо большее распространение получил электрофорез в твердотельном носителе, насыщенном буфером. Некоторые носители лишь слабо или неспецифически реагируют с ма-кромолекулярными компонентами раствора к ним относятся бумага, целлюлоза для тонкослойной хроматографии и ацетат целлюлозы. В других материалах при движении молекул происходит отставание молекул одних типов от молекул других типов к ним относятся полиакриламидные и агарозные гели (в которых происходит сортировка молекул по размерам) и бумажные ионообменники (в которых осуществляется избирательная задержка заряженных молекул). [c.302]

Третий физический метод — электрофорез, не получил такого широкого распространения в исследовании вирусов, как ультрацентрифугирование. Классический метод Тизелиуса (фронтальный электрофорез) для очистки и фракционирования вирусов непри-годен. Более удобен зональный электрофорез в градиенте плотности, предложенный в 1953 г. Брекком [217]. Для препаративной очистки вирусов животных этот метод стали применять с 1958 г. после работ Крамера с сотр. [271]. Очень широкое распространение для фракционирования белков и нуклеиновых кислот получил метод дискового электрофореза в полиакриламидном геле, предложенный в 1962 г, Рейсфельдом с сотр, [684]. [c.44]

Наиболее эффективный электрофоретический анализ белков п нуклеиновых кислот достигается применением зонального электрофореза в мелконористой среде — полиакриламидном геле на основе их молекулярного веса и электрофоретической подвижности. Электрофоретические аппараты с полиакриламидным гелем обладают следующими преимуществами очень высокой разрешающей способностью, быстротой и высокой воспроизводимостью [c.208]