Электрофорез фронтальный

Электрофорез проводят либо в свободной незакрепленной среде (в свободной жидкости) — фронтальный электрофорез, либо в закрепленной среде — зональный электрофорез — на крупнопористых носителях (фильтровальная бумага, целлюлоза, порошкообразная пластмасса, агар-агар, ацетилцеллюлоза, стеклянный порошок) или на мелкопористых носителях (силикагель, полиакриламидный гель, целлюлоза, оксид алюминия, крахмал и др.). [c.237]

Разработан ряд электрофоретических методов для анализа белков и их смесей. В методе движущейся границы, или фронтального электрофореза, определяется скорость перемещения в электрическом поле резкой границы между раствором исследуемого вещества и растворителем. Для препаративного разделения смесей более удобен метод зонального электрофореза, в котором раствор исследуемого вещества помещают вначале в виде узкого слоя между двумя слоями растворителя. За достаточно большой промежуток времени вещества с различной подвижностью расходятся на значительное расстояние, их зоны перестают перекрываться и продукты разделения могут быть [c.172]

Электрофорез в градиенте плотности сочетает в себе многие преимущества как фронтального метода, так и зонального электрофореза на инертном носителе, и в то же время не имеет некоторых их недостатков. В градиенте плотности можно разделять как крайне малые, так и значительные количества вещества. В первом случае особенно важно отсутствие опасности адсорбции, которой невозможно избежать, если применяется твердый носитель. Применяя для анализа радиоактивную метку или измерения биологической активности, можно работать с субмикрограммовыми количествами вещества. Метод вполне пригоден для разделения низкомолекулярных веществ. [c.66]

В плане этих общих подходов электромиграционный метод близок к хроматографии (те же два основных направления повышения эффективности разделения) — поиск методических приемов лучшего разрешения зон при постоянных Кс и использование химических превращений с целью увеличения Кс. Похожи и основные схемы практического осуществления процесса разделения на колонке, на бумаге, в тонком слое. Возникший на заре развития электромиграции метод подвижной границы внешне аналогичен фронтальному анализу в хроматографии. В этом случае движение разделяемых ионов в электрическом поле происходит непосредственно из раствора их смеси. В наиболее распространенном случае зонного электрофореза просматривается общность с проявительным режимом элюирования в хроматографии. Узкая полоса исходной смеси веществ в среде определенного электролита разделяется на индивидуальные зоны. Существует внешняя аналогия противоточного и двухмерного электромиграционного разделения с соответствующими способами осуществления хроматографического процесса. Поэтому при всем принципиальном различии методов по природе химических процессов, лежащих в их основе, хроматографию и электрофорез иногда даже рассматривают как смежные методы [95]. [c.243]

Данные фронтального электрофореза часто помогают правильно выбирать условия и идентифицировать белковые компоненты при разделении смесей в зональном электрофорезе. [c.63]

Исследование белковых соединений методами зонального и фронтального электрофореза. [c.331]

Задача электрофореза в большинстве случаев заключается не в идентификации ионов, образующихся в результате электролиза, и оценке их распределения, а в определении скорости миграции к электродам добавляемых заряженных частиц. При условии, что расстояние между электродами достаточно велико, разницу в скоростях движения индивидуальных частиц можно использовать для разделения смесей. Применяют два метода электрофореза метод свободно движущейся границы — фронтальный электрофорез и зонный электрофорез. [c.465]

Как указывалось выше, для того чтобы границы при электрофорезе были стабильны в поле тяжести, нужно работать при достаточно высокой весовой концентрации исследуемого веш,ества. В то же время эквивалентная концентрация последнего должна быть как мон но меньше по сравнению с концентрацией буфера — иначе невозможны точные измерения. Таким образом, фронтальный метод особенно удобен для исследования белков, эквивалентный вес которых очень велик, особенно вблизи изоэлектрической точки (р1). Кроме того, малый коэффициент диффузии макромолекул приводит к сравнительно небольшому размыванию границ даже при длительных опытах. Для малых ионов метод непригоден из-за их большого коэффициента диффузии и малого эквивалентного веса, а главное потому, что инкремент показателя преломления у них не от.личается от инкремента ионов буфера. Это делает невозможным сколько-нибудь точное рефрактометрическое определение концентрации. [c.62]

Фронтальный электрофорез (метод движущейся границы). На фиг. 22 изображена схема прибора для фронтального электрофореза. Прибор сначала частично заполняют раствором белка, а затем с помощью специального приспособления создают резкую границу между раствором белка и чистым растворителем. После этого погружают электроды в буферный раствор и помещают весь прибор в водяной термостат, предназначенный для отвод тепла, выделяющегося в процессе электрофореза, и для поддержания постоян- [c.76]

Вследствие этого с помощью фронтального метода изучались почти исключительно белки и некоторые другие нолиэлектролиты (например, нуклеиновые кислоты). Важным преимуществом при изучении таких лабильных веществ, как белки, является то, что исследование ведется в очень мягких условиях, при низкой температуре, определенных значениях pH и ионной силы, отсутствует опасность адсорбции и денатурации на поверхности твердой фазы, которой нелегко избежать при зональном электрофорезе (см. ниже). [c.62]

Метод движущейся границы (фронтальный электрофорез). ... 43 [c.40]

Главнейшие различия между фронтальным и зональным методами связаны именно с применением поддерживающей среды. Поэтому термин электрофорез в поддерживающей среде , или электрофорез на носителе , вероятно, лучше отражал бы суть дела, чем термин зональный электрофорез , введенный Тизелиусом. Все же мы будем пользоваться последним как более общепринятым. [c.42]

Для сильных электролитов теория Дола количественно оправдывается на опыте. Хотя белки заведомо являются слабыми электролитами, теория Дола помогает качественно разобраться в общей картине, наблюдающейся при фронтальном электрофорезе белковых смесей. Основные выводы ее состоят в следующем [c.53]

Принципы, положенные в основу конструкции прибора Тизелиуса, описаны выше. Современный аппарат для фронтального электрофореза является сложным и дорогим устройством, вклю- [c.62]

Перечислим некоторые возможные применения фронтального электрофореза. [c.63]

Определение электрофоретических свойств индивидуальных белков. Фронтальный электрофорез — единственный метод, позволяющий определять подвижность и изоэлектрическую точку белка с очень высокой точностью. Подвижность и р1 белка являются его важной характеристикой, нужно только иметь в виду, что каждое измерение дает характеристики, справедливые лишь для определенных значений pH, ионной силы и состава буфера. [c.63]

При фронтальном электрофорезе небольшой объем раствора, содержащего разделяемые. компоненты, помещают в трубку с раствором электролита. Под влиянием приложенного поля различные компоненты двигаются к электродам с различной скоростью и разделяются на зоны. Однако после отключения электрофоретической ячейки все зоны начинают смешиваться за счет свободной диффузии. Следовательно, положение разделяемых частиц в ячейке следует оценивать в процессе их миграции. Положение различных зон обычно оценивают при помощи сложной оптической системы, которая фиксирует изменение показателя преломления на границе частей раствора, имеющих различный состав (эффект Шлирена). Для проведения таких измерений требуется дорогостоящее оборудование необходим также строгий контроль экспериментальных условий. В связи с этим большинство электрофоретических измерений в настоящее время проводят методом зонного электрофореза. [c.465]

Определение однородности индивидуального белка. Такое определение часто бывает крайне необходимо, но является сложной задачей. До недавнего времени однородность электрофоретического поведения белка нри фронтальном электрофорезе при различных значениях pH считалась наиболее надежным критерием. Разрешающая способность метода велика в некоторых случаях присутствие компонент с мало отличающимися подвижностями проявляется в расширении границы в процессе движения. Характерным отличием такого расширения от расширения, вызванного диффузией, является то, что при изменении направления движения (переключении тока) граница, наоборот, сужается. Такие измерения проводят обычно при малых напряженностях поля и вблизи изоэлектрической точки, чтобы уменьшить возмущающие эффекты электроосмоса, конвекции и градиентов проводимости. Существующие теории позволяют количественно определить степень неоднородности (распределение подвижностей) по скорости расширения границы. Подобная неоднородность была обнаружена для многих белков, в частности для -глобулина человека. [c.64]

Сыворотка крови была первым объектом, изученным с помощью фронтального метода. Но особенно удобным оказался зональный электрофорез на бумаге. Разрешающая способность последнего обычно не хуже, чем у фронтального метода, а простота и доступность аппаратуры, быстрота подготовки и проведения опыта и последующего анализа, малое количество требующейся сыворотки привлекло внимание врачей-клиницистов и физиологов. [c.100]

Обычно электрофорез проводят в вероналовой буферной системе при pH около 8,5. В этих условиях на электрофореграмме наблюдается не меньше 4 ясно различимых пиков отрицательно заряженных белков самый большой и быстро движущийся — альбумин, затем а- и Р-глобулины и, наконец, самый медленный — Т-глобулин (рис. 2). Названия эти сложились исторически альбумин от глобулинов умели отделять фракционным солевым осаждением еще в XIX в. Компоненты же глобулина, впервые разделенные фронтальным электрофорезом, были обозначены буквами греческого алфавита в порядке скорости их движения. [c.100]

Метод движущейся границы (фронтальный электрофорез) неудобен для препаративного разделения. Для этой цели более удобным оказался так называемый зональный электрофорез, различные модификации которого появились позднее. При зональном электрофорезе раствор исследуемых веществ помещают вначале в виде более или менее узкого слоя (зоны) между двумя слоями растворителя. За достаточно большое время вещества с различной подвижностью расходятся на такое расстояние, что занимаемые ими зоны не перекрываются и могут быть извлечены по-отдельности. [c.41]

Различают два варианта электрофореза фронтальный (простой) и зонный (на носителе). В первом случае небольшой объем раствора, содержащего разделяемые компоненты, помещают в трубку с раствором электролита. Во втором случае передвижение происходит в стабилизирующей среде, которая удерживает часпщы на местах после отключения электрического поля (рис. 7.12). [c.255]

Существуют два различных метода электрофореза фронтальный электрофорез, который проводят в свободной незакрепленной среде, и зональный электрофорез — в закрепленной среде (стабилизированная жидкость или носители). Они имеют единую аппаратурную схему источник тока, камеру для электрофореза, два электрода, соединяющих камеру с источником тока, и аппаратуру для сбора и идентификации разделенных веществ. Для электрофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофореза в полиакриламидном геле венгерской фирмы Реанал ), так и наборы, составляемые экспериментатором из отдельных приборов (универсальный источник питания УИП-1, двухлучевой регистрирующий микрофотометр ИФО-451 и др.). [c.144]

Электрофоретические свойства очень чувствительны к изменениям размеров, формы, числа заряженных групп макромолекулы, которые часто нельзя обнаружить другими методами. Изменения, вызванные старением при хранении растворов, различными химическими воздействиями, небольшие видовые различия и т. д., могут быть легко замечены при фронтальном электрофорезе. Примером является найденное Полингом с сотрудниками различие в полон ении изоэлектрической точки нормального гемоглобина человека и гемоглобина больных серповидно-клеточной анемией (Ар1=0,22). Как показал позднее Ингрэм, это различие вызвано заменой всего одной кислой аминокислоты в белковой макромолекуле на нейтральную (глутаминовой кислоты на валин). [c.63]

Различают след, методы электромифац. разделения смесей зонный электрофорез фокусирующий ионный обмен фронтальные методы изотахофорез. [c.436]

Зонный электрофорез. Главное отличие зонного электрофореза от фронтального состоит в том, что при зонном э,лектрофорезе используется поддерживающая среда, в которой осуществляется движение вещества, тогда как при фронтальном электрофорезе ионы свободно перемещаются в растворе. Поддерживающей средой, или носителем, служат обычно бумага, целлюлоза, крахмальные гели или блоки, пористые по,лиуретаны. и полиакрил-алшдиые гели. На фиг. 24 приведена схема прибора для зонного электрофореза. [c.77]

Чаще всего при фронтальном электрофорезе применяются серебряные электроды, покрытые слоем хлористого серебра и погруженные в насыщенный раствор МаС1, налитый в нижнюю часть электродных сосудов. Тогда прибор может быть герметически закрыт, так как газы в этом случае не выделяются. Во время опыта на катоде происходит электрохимическое восстановление серебра, а па аноде — обратная реакция, приводящая к накоплению Ag l. При повторных опытах анод и катод меняют местами. Первоначальное осаждение А С1 на серебре производится также электрохимически. [c.45]

Разделение смесей белков. Фронтальный электрофорез широко применялся для анализа белковых смесей, особенно белков сыворотки крови, а также смесей, экстрагированных из самых различных органов и тканей животных и растений. Качество разделения и точность определения состава резко зависят от состава, pH и ионной силы буфера. Так, для сыворотки крови обычно рекомендуют вероналовые буферные системы при pH около 8. Важным правилом является такой выбор pH, когда все компоненты смеси заряжены одноименно — это уменьшает опасность ассоциации компонентов и выпадения осадка. [c.64]

Для препаративного разделения смесей фронтальный электрофорез мало пригоден потому, что в чистом виде может быть выделен только самый быстрый (на восходящей стороне) и самый медленный (на нисходящей) компонент смеси, да и то не целиком, а лишь частично. Кроме того, само извлечение компонентов из узких областей легко копвектирующего раствора неудобно и требует большого навыка (хотя соответствующие попытки и делались). [c.65]

Гели в качестве поддерживающей среды при электрофорезе обладают рядом важных особенностей. Главная из них та, что размеры пор геля могут быть сравнимы с размерами белковых макромолекул. В этих условиях подвижность частиц очень резко зависит от их размеров. Таким образом, вводится дополнительный фактор, влияющий на разделение. Кроме того, адсорбция во многих гелях крайне мала. Но этим причинам электрофорез в гелях обладает чрезвычайно высокой разрешающей способностью по отношению к сложным белковым смесям — значительно более высокой, чем все другие методы. Это особенно выражено в крахмальном геле, предложенном Смитисом в 1955 г., и в синтетическом полиакриламидном геле, который все чаще используют в последнее время. В этих гелях, например, удается обнаружить до 30 компонентов сыворотки крови, в то время как фронтальный электрофорез дает только 5—7. Агаровый гель хотя и обладает малой адсорбцией по отношению к белкам, дает худшее разделение, так как размер пор в нем относительно велик. Но и в агаре было замечено, что отношение подвижностей больших и малых ионов уменьшается с увеличением концентрации агара (т. е. с уменьшением размера пор). [c.95]

Различают фронтальный и зональный электрофорез [8]. При фронтальном электрофорезе различные компоненты смеси выявляются в виде серии границ, соответствующих зонам веществ, частично перекрывающих одна другую. При зональном электрофорезе каждый компонент смеси выявляется в форме обособленной зоны. Зональный электрофорез проводится на инертном носптеле, пропитанном электролитом. В качестве носителей использовались различные вещества желатин, асбестовое волокно, порошок стеклянной ваты, силикагель, крахмал, бумага и др. Необходимыми требованиями к носителям являются их инертность по отношению к исследуемым веществам н незначительная адсорбирующая способность, Выбор электролита, его концентрация и pH зависят ог разделяемых веществ. [c.245]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология