Электрофорез белков на бумаге

Исследуемый белок гидролизуют трипсином и гидролизат подвергают электрофорезу на бумаге. Ориентируясь по контрольной полоске, вырезают полоску для аналитического диагонального электрофореза и осторожно опрыскивают ее карбоксипептидазой В, растворенной в 0,1%-ном бикарбонате аммония. Опрысканную полоску на 1 ч помещают в эксикатор, содержащий воду, при 37°С. После инкубации полоску высушивают и подвергают вновь электрофорезу под прямым углом к первоначальному направлению. [c.113]

Рассмотрим теперь метод пептидных карт. Его первый этап состоит в разрыве дисульфидных связей, далее белок денатурируют и расщепляют ферментами, например трипсином или пепсином. В результате получается набор пептидов, размер и аминокислотный состав которых характерен для каждого отдельного белка. Смесь пептидов наносят на лист хроматографической бумаги и проводят в одном направлении хроматографию, а в другом — электрофорез. Пептиды локализуются в виде отдельных пятен, образуя характерную картину ( отпечатки пальцев ), Метод пептидных карт особенно полезен для выявления малых [c.167]

Тонкие различия в первичной структуре родственных белков часто удается выявить методом отпечатков пальцев . Метод этот состоит в том, что белок подвергают частичному перевариванию с помощью одного или нескольких протеолитических ферментов, а затем разделяют продукты гидролиза и идентифицируют их, пользуясь для этого либо электрофорезом, либо хроматографией на бумаге. На фиг. 32 приведены полученные таким способом отпечатки пальцев , или пептидные карты , нормального и аномального гемоглобинов. Детальное изучение этих пептидных карт показывает, что все пептидные пятна, за исключением одного, идентичны. Таким способом генетически измененный структурный элемент выявляется очень легко, и для установления природы структурного изменения нет надобности устанавливать полную аминокислотную последовательность всей молекулы. Действительно, в ряде случаев весьма определенные указания относительно природы имеющегося замещения можно получить просто исходя из результатов анализа аминокислотного состава соответствующих пептидов, выделенных из двух белков. Но, конечно, однозначные доказательства замены одной аминокислоты на другую получают только после установления аминокислотной последовательности анализируемых пептидов. [c.96]

Адсорбция на носителе. При работе с пористым носителем поверхность раздела фаз очень велика и даже сравнительно слабая адсорбция может привести к полной неудаче при электрофоретическом разделении. Причины адсорбции не всегда достаточно ясны. По-видимому, силы неэлектростатического происхождения играют большую роль по отношению к белкам, чем к малым ионам. Адсорбция последних (пептидов, аминокислот и т. д.) связана с наличием ионизованных групп на поверхности носителя. Установлено, что в целлюлозе и крахмале, например, имеется значительное количество карбоксильных групп. Так как эти группы заряжены отрицательно, опасность адсорбции относительно мала для отрицательных ионов, но велика для положительных. Делались попытки уменьшить заряд бумаги этерифи-кацией карбоксилов диазометаном. С белками рекомендуется работать при pH выше их изоточки, тогда электростатическое отталкивание препятствует адсорбции. Этот эффект можно усилить, используя ионообменную бумагу, в которой с поверхностью целлюлозных волокон химически связано значительное число ионизированных групп с зарядом, противоположным заряду исследуемого иона. Для уменьшения адсорбции белков применялись также детергенты иногда помогает предварительная обработка носителя раствором исследуемого белка. Хотя в некоторых случаях эти меры приносят желаемый эффект, адсорбция часто (для белков — почти всегда) наблюдается в той или иной степени при электрофорезе на твердом носителе. Обратимая адсорбция проявляется в уменьшении скорости движения и в образовании хвостов у движущихся зон, что ухудшает разделение и затрудняет количественный анализ. Необратимая адсорбция приводит к тому, что на всем пути зоны остается равномерный след — адсорбированный белок, а количество вещества в зоне постепенно уменьшается. Если это количество мало, зона может вообще исчезнуть по дороге. Иногда адсорбция сопровождается денатурацией белка, частичной или полной потерей его биологической активности. [c.81]

В сравнении с хроматографическими методами все другие способы очистки белков за последние годы начинают несколько отступать на задний план. Все же следует упомянуть здесь о препаративном электрофорезе, который применяется довольно широко в разных исполнениях. Для фракционирования малых весовых количеств белков разделение смеси белков на зоны ведут в том или ином стабилизирующем наполнителе для ликвидации конвекционного перемешивания. Пригодными наполнителями являются волокна целлюлозы, в частности бумага. Бумажный электрофорез белков похож на разделение аминокислот и пептидов на бумаге, о чем мы уже говорили выше. Другой широко употребительной средой является гель крахмала, который разрезается на кусочки после завершения электрофореза, и из каждого куска элюируется содержащийся в нем белок. [c.131]

Высокоэффективным методом разделения является сочетание электрофореза на бумаге с обычной хроматографией. При этом сначала через влажную бумагу, на которую нанесена смесь, пропускают ток высокого напряжения, а затем смесь хроматографируют с помощью подходящего растворителя в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. В результате достигается разделение первоначальной смеси в двух измерениях. Применение такого метода к продуктам ферментативного расщепления белков позволяет получить двухмерную картину, которую называют пептидной картой. Каждый белок дает характерную для него при каждом конкретном способе расщепления картину. Локализацию отдельных компонентов во многих случаях определяют с помощью специфических красителей. При определении аминокислот и пептидов в качестве такого красителя используют, например, нингидрин. Если производится элюция адсорбированных компонентов, то удобнее всего устанавливать их присутствие в элюате спектрофотометрически. Вероятно, наиболее тонким методом разделения белков следует считать иммуноэлектрофорез, при котором эффект достигается за счет использования различий в двух свойствах электрофоретической подвижности и иммунологической специфичности. [c.220]

Обхций белок сыворотки крови определяли рефрактометрически, белковые фракции — методом электрофореза на бумаге. Для изучения скорости обновления белков в печени крысам за 24 часа до декапитации вводили меченный по сере радиоактивный метионин в дозе 5000 ими./мин на 1 г веса тела внутрибрю-шинно. Обработку ткани печени для подсчета радиоактивности белка производили по описанному в литературе методу (И. И. Иванов и др., 1955). Для учета возможного изменения проницаемости ткани для изотопа определяли относительную активность белка печени по предложенной Д. Э. Гродзенским формуле относительная активность белка печени равна отношению радиоактивности белка в 1 г печени и 1 г цельной ткани печени. [c.387]

На следующем этапе исследования белок подвергают ферментативному гидролизу на пептиды, например под действием трипсина, химотрипсина и пепсина. Разделение пептидов осуществляют с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге. Затем, пользуясь ДНФБ-методом, определяют аминокислотную последовательность, начиная с Ы-конца. [c.289]

Полоновский и Джейл [140] установили, что в сыворотке крови присутствует компонент, который специфично связывает гемоглобин. Эти исследования были продолжены Джейлом и др. [141], которые с помощью электрофореза на бумаге нашли, что белок, связывающий гемоглобин, мигрирует как аг-глобулин. Белок, связывающий гемоглобин,— гаптоглобин — был выделен Джейлом и Буссье [142] его молекулярный вес, рассчитанный по данным ультрацентрифугирования, равен 85 ООО [143, 144]. [c.252]

Рис. 13. Радиоавтограммы тирозинсодержащих пептидов ГАФД, меченных йодом-131. Белок реагировал с К 4 в боратном буфере, pH 9,2 в течение 30 секунд или 30 минут (Н1 и Нг, соответственно) и 7 М мочевине, pH 9,2 (М1 и Мг, соответственно). Меченые белки подвергали действию трипсина, пептиды гидролизата разделяли с помощью электрофореза на бумаге прн pH 6,5 в одном напраслении и хроматографии в системе бутанол — уксусная кислота— вода в направлении 2.

Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций [1 ]. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этом увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом. [c.11]

Рис. 2. Секреция 1дО-подобных иммуноглобулинов восемью клопами одной перевиваемой линии лнмфобластондных клегок человека. Клеточную суспензию культуры (2-10 клеток/мл) метили в процессе биосинтеза в течение 12 ч С-лейцином (1,5 мкКи/мл). Надосадочные жидкости каждой культуры инкубировали в течение ночи при 4°С с кроличьей антисывороткой к б-цепям человека и с убитой суспензией стафилококков, несущих белок А. Клетки стафилококка и иммунные комплексы осаждали и отмывали 3 или 4 раза ЗФР, центрифугируя 10 мин при бОООд. Осадки суспендировали в буфере для нанесения и инкубировали 3 мин при 100°С. Затем проводили электрофорез в 12,5%-НОМ геле при силе тока 20 мА на пластинку. Гель фиксировали, окрашивали, обесцвечивали и высушивали на фильтровальной бумаге. Высушенную пластинку геля экспонировали на медицинской рентгеновской плеике Ко(1 гех. Полученные полипептиды имели приблизительно следующие молекулярные веса а — 63 000 Ь — 55 000 с — 51 ООО ё — 28 000 е — 25 000 / — 24 ООО.

Справочник химика 21

Химия и химическая технология