Агароза отрицательно заряженная

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Нуклеиновые кислоты характеризуются отчетливым отрицательным зарядом и очень высокой молекулярной массой. Поэтому нейтральные гомогенные гели с достаточно большими порами обеспечивают хорошее разделение этих соединений. Размер пор, требуемый для исследования нуклеиновых кислот и их субъединиц, можно определить методом гель-электрофореза при градиенте концентрации, как для белков (см. табл. 12.6). Если механические свойства неплотного полиакриламидного геля непригодны, можно использовать смешанный гель, содержащий 2,5% полиакриламида и 0,5% агарозы. При анализе субъединиц более низкой молекулярной массы концентрацию полиакриламида увеличивают до 3% при 0,5%-ной концентрации агарозы в [c.350]

Такие гипотетические смешанные адсорбенты до сих пор не получены. Следовательно, пока эта идея остается лишь предположением. Так как многие лиганды заряжены отрицательно, автоматически будет проявляться катионообменный эффект, и хотя предпочтительно работать с системой при таких значениях pH и ионной силы, которые позволяют избегать подобных эффектов, однако даже в идеальном случае это трудно достижимо. Например, киназа с незначительным сродством к АМР не связывается с АМР-агарозой в 0,1 М фосфатном буфере, но может связаться со смешанным катионообменником за счет отрицательного заряда АМР в более слабом буфере, таком, как 0,01 М МЭС или МОПС. Хотя при этом могут связываться и другие основные ферментные белки, это не означает, что они будут вымываться при аффинной элюции с помощью свободного АТР, используемого для элюции киназы, если только концентрация АТР не будет значительно повышать ионную силу. [c.158]

В данных методах совмещены электрофоретическая миграция антигенов в агарозе с последующей иммунопреципитацией в геле. В результате первого процесса происходит частичное разделение смеси антигенов, поскольку скорость их миграции в геле зависит от суммарного заряда при данном рП буферного раствора. Кроме того, отрицательно заряженные молекулы быстро мигрируют в гель, содержащий антитела, что ускоряет преципитацию и сводит к минимуму латеральную диффузию. [c.215]

Фракционирование нуклеиновых кислот и их фрагментов электрофорезом в ПААГ и гелях агарозы отличается от фракционирования белков некоторыми характерными особенностями, вытекающими из различия природы этих биополимеров. Главное, что отличает нуклеиновые кислоты,— это неизменно отрицательный и значительный по величине суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты. Величина этого заряда мало зависит от pH окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот, поэтому в подавляющем большинстве случаев фракционирование их при электрофорезе идет за счет различия размеров молекул, а. не их зарядов. [c.120]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

Большинство преципитирующих антител относится к классу иммуноглобулинов О (1дО), обладающих лишь очень слабым отрицательным зарядом при pH 8—9. Поэтому электроосмоти-ческий поток смещает 1 0 к катоду. Электроэндосмос заметно уменьшается при замене агара агарозой. Путем подбора определенных соотношений агара и агарозы можно регулировать скорость эндосмоса, создавая тем самым оптимальные условия для электросинереза. Очевидно, что антитела следует помещать ближе к аноду, а антиген — ближе к катоду. Если расположить рядом несколько лунок с антигенами, то последние можно сравнивать между собой подобно тому, как это делается в методе двойной иммунодиффузии [186]. Видимые линии преципитации образуются в течение 1—2 ч. Избыток реагентов удаляют, продолжая электрофорез после образования преципитатов. При этом нет надобности отмывать гель перед окрашиванием, что позволяет в течение 3—4 ч получить полную картину окрашенных полос преципитации. [c.247]

П. Свойства агара и агарозы и электроэндосмос. При ще лочных pH буфера агар несет незначительный отрицательный заряд, обусловленный ионизацией неорганических кислых групп. В результате гель приобретает постоянный заряд, сбалансированный ионами НзО растворителя. Это приводит к возникновению в жидкой фазе геля слабого катодного тока, называемого электроосмосом [12] или электроэндосмосом. Коммерческие препараты агара в отличие от агарозы обладают ярко выраженными электроэндосмотическими свойствами, и в результате Рг- и -глобулины, которые имеют в сыворотке при pH 8,6 сильный отрицательный заряд (это молекулы с самым низким значением р1), мигрируют к катоду (рис. 6.11). В этом нет большой беды, поскольку, правильно подобрав анионы буфера, можно разделить изучаемые антигены как в направлении к катоду, так и к аноду. Таким образом, работая с агаровыми гелями, лучше вырезать лунки в центре пластины, чтобы обеспечить миграцию белков к катоду. Часто наилучшее разделение иммуноглобулинов на классы достигается именно в агаровом геле. [c.220]

Фирма Pharma ia недавно начала выпуск агарозы для ИЭФ под маркой Agarose IEF . В максимально очищенную агарозу, содержащую, тем не менее, неизбежный минимум отрицательных зарядов, фирма вносит строго дозированное количество прочно связанных с матрицей положительно заряженных групп. В результате такой обработки эндосмос при использовании этой агарозы сведен почти до нуля. Точнее, он практически отсут- [c.42]

Ток жидкости к катоду происходит благодаря наличию иммобилизованных отрицательных зарядов (карбоксилат-, сульфат- и фосфат-ионов), обычных для биологических полимеров. Даже самая чистая агароза несет все же несколько отрицательных зарядов и электроэндоосмос может быть устранен лишь в том случае, если гель формируется в присутствии небольших количеств положительно заряженных полимеров типа ДЭАЭ-декстрана, нейтрализующих этот эффект. В препаративном электрофорезе электроэндоосмос не является слишком серьезной проблемой, поскольку здесь более важна не причина перемещения полосы белка, а достигаемое при этом отделение ее от других белковых компонентов смеси. [c.219]

Рис. 4-46. Три типа матриксов, используемых для хроматографии. При ионообменной хроматографии (А) нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и pH элюирующего раствора, которые для достижения эффективного разделения можно варьировать определенным образом (как на рис. 4-47). При хроматографии по методу гель-фильтрапии (Б) матрикс инертен, но содержит поры. Низкомолекулярные соединения проникают внутрь частиц матрикса. Оказавшись при этом в относительно большем объеме, они проходят через колонку медленнее. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Поскольку в продаже имеются полисахариды с самым различным размером пор, их можно использовать для фракционирования молекул с молекулярной массой от 500 до 5 х 10 дальтон. При аффинной хроматографии (В) используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого pH. Однократная хроматография на такой колонке позволяет

В другой работе [Howard, Traut, 1973] разделение рибосомальных белков по заряду в первом направлении вели тоже в 4%-ном ПААГ в присутствии 6 М мочевины, но в 0,4 М Трис-боратном буфере, pH 8,7. При этом pH часть белков рибосом оказывается заряженной отрицательно, а другая часть —положительно. Белковый препарат смешивали с расплавленной 1%-ной агарозой и вносили в середину трубки, наслаивая его на заполимеризованный нижний участок ПААГ. После затвер-девания агарозы в трубку заливали новую порцию смеси моно меров и полимеризовали верхний участок ПААГ. При этом в интересах концентрирования полос на обеих границах с ПААГ агарозу с белковым препаратом полимеризовали в разбавленном (0,06 М) Трис-боратном буфере. При включении напряжения миграция белков шла в обе стороны —к катоду и аноду. Во втором направлении разделение белков вели по их размерам, но без обработки ДДС-Na. Для этого использовали пластину еще более мелкопористого геля, чем в предыдущей работе (Т= = 18,25 С=1,37), полимеризованного в 0,9 М уксусной кислоте, титрованной КОН до pH 4,5, также с добавлением 6 М мочевины. В этом случае все белки были заряжены положительно и мигрировали к катоду. В качестве лидирующего красителя использовали 0,1%-ный раствор пиронина. Из цилиндрика геля [c.79]

В другой работе [Howard, Traut, 1973] разделение рибосо-мальных белков по заряду в первом направлении вели тоже в 4%)-ном ПААГ в присутствии 6 М мочевины, но в 0,4 М Трис-боратном буфере, pH 8,7. При этом pH часть белков рибосом оказывается заряженной отрицательно, а другая часть—положительно. Белковый препарат смешивали с расплавленной 1%)-ной агарозой и вносили в середину трубки, наслаивая его на заполимеризованный нижний участок НААГ. После затвердевания агарозы в трубку заливали новую порцию смеси мономеров и полимеризовали верхний участок ПААГ. При этом в интересах концентрирования полос на обеих границах с ПААГ агарозу с белковым препаратом полимеризовали в разбавленном (0,06 М) Трис-боратном буфере. При включении напряжения миграция белков шла в обе стороны—к катоду и аноду. [c.79]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология