Тогавирусы

Реакция радиального гемолиза (РРГ). Реакция основана на феномене гемолиза сенсибилизированных антигеном эритроцитов под влиянием вирусспецифических антител в присутствии комплемента в агарозном геле. Метод широко применяется для серологической диагностики гриппа, ряда других респираторных инфекций, краснухи, паротита, арбовирусных инфекций, вызываемых тогавирусами. [c.273]

Тогавирусы 35 вО - Желтая лихо- [c.96]

Капсиды с оболочкой Ретровирусы (онкогенные) вирусы саркомы, лейкозов, карциномы Тогавирусы вирус лесов Семлики, вирусы энцефалита, желтой лихорадки [c.137]

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ТИТРОВАНИЕ И ОЧИСТКА ТОГАВИРУСОВ [c.66]

Методы, используемые для определения инфекционности, зависят от имеющегося оборудования, конкретного вида вируса и характера данных, которые должны быть получены. Так, например, в некоторых странах заражение новорожденных мышат является более удобным и дешевым способом титрования инфекционности арбовирусов, чем заражение культур клеток комаров, в то время как в других странах ситуация противоположная. Кроме того, в тех случаях, когда нужна максимальная точность, используют линии клеток комаров. С другой стороны пока не доказано, что все тогавирусы способны размножаться в этих клетках. [c.66]

При интрацеребральном заражении новорожденных мышат содержащим тогавирусы материалом во многих случаях удается получить вирус в высоком титре. При заражении многими вирусами мышата погибают в течение 2—8 сут, хотя для некоторых природных изолятов может потребоваться один или два слепых пассажа (см. ниже), прежде чем будет достигнут высокий титр. Мозг зараженных мышат в качестве источника вируса следует брать не раньше чем за несколько часов до их гибели. Обычно в последние сутки жизни у зараженных животных нарушается координация движений, часто наступает паралич задних конечностей, и через несколько часов они погибают. Следует ежедневно наблюдать за инфицированными животными гибель в течение первых суток после заражения считается неспецифической. [c.67]

Культивирование, титрование и очистка тогавирусов [c.69]

Выделение и наращивание тогавирусов в культуре клеток комаров [c.73]

Показано, что во многих случаях культуры клеток беспозвоночных более чувствительны к альфа- и флавивирусам, чем новорожденные мышата или культуры клеток позвоночных В особенности это относится к первичному выделению вирусов Если в лаборатории имеются условия для культуральной ра боты, клетки беспозвоночных можно легко нарастить и исполь зевать для постоянной работы с тогавирусами. Для некоторых линий клеток комаров характерна высокая чувствительность к переносимым комарами альфа- и флавивирусам [3, 4], причем многие из этих вирусов способны образовывать бляшки, хотя результаты, по-видимому, до некоторой степени зависят от конкретных условий эксперимента [5], Если какой-либо конкретный метод не дал хороших результатов, имеет смысл попытаться применить другой. Например, обычно клетки комаров для культивирования и выделения вирусов инкубируют при 27—28°С, но в случае вируса денге лучшие результаты получают при повышении температуры до 32 °С [6]. Имеется ряд стандартных клеточных линий, и если размножение вируса не удается в одной из них, имеет смысл испытать другую. Подробные сведения об используемых средах приведены в при ложе- [c.73]

Наращивание тогавирусов в культурах клеток комаров [c.74]

Наращивание тогавирусов в клетках млекопитающих [c.78]

С помощью модификации описанного выше метода можно определить способность антисыворотки защищать новорожденных мышат от заражения летальной дозой тогавируса, [c.85]

Как и для остальных вирусов, агглютинирующих эритроциты, в реакции гемагглютинации определяют число физических частиц тогавирусов, а не инфекционный титр вируса. Тем не менее во многих случаях это хороший способ оценки качества вирусного препарата. [c.91]

Некоторые тогавирусы лучше всего агглютинируют эритроциты при 4°С, а другие — при 22°С поэтому в начальных опытах, имеет смысл поставить реакцию при обеих температурах. [c.93]

Титрование гемолизина тогавирусов [c.93]

Культивирование тогавирусов уже детально рассмотрено в одном из предыдущих разделов настоящей главы. Оптимальную систему для культивирования следует подбирать специально в каждом случае. В целом лучшей можно считать ту систему, в( которой вирус дает максимальный титр, хотя нужна иметь в виду, что очистка вируса из тканей зараженных животных, например экстрактов мозга, затруднена в связи с большим содержанием в препаратах клеточных компонентов кроме того, радиоактивное мечение вируса в организме животных, как правило, невозможно. В тех случаях, когда вирус хорошо размножается в культуре ткани, имеет смысл потратить некоторое время, чтобы оптимизировать его выход. Выбор же таких параметров, как чувствительная линия клеток, культуральная среда, множественность инфекции, температура инкубации и время сбора вируса, существенно влияет на выход. При опти- [c.95]

Еще одна до сих пор нерешенная проблема заключается в вариабельности вируса при серийном пассировании в одном и том же хозяине или при смене хозяина. Известно, что многие тогавирусы в клетках комаров дают персистентную инфекцию, в то время как в клетках млекопитающих персистенция может и не наблюдаться. Вирус, образующийся при таких персистентных инфекциях, часто имеет сниженную вирулентность для мышей и для человека. Возможность подобных изменений нужно иметь в виду, например, при получении гемагглютинина из длительно культивируемых зараженных клеток (см. выше). [c.105]

Рйс. 3.5. Действие тогавируса на моиослойную культуру клеток ковров (линия АР61). а — кон- РЯ ая незараженная культура О —гигантский синцитий, возникли в результате слияния мембран удельных клеток в — округлившиеся клетки, которые могут отделиться от субстрата [c.75]

Обычно для титрования тогавирусов используют новорож- ных мышат (например, для определения защитного титра гител). Однако в некоторых случаях использование клеточ- X культур явно предпочтительнее. [c.83]

Данный метод основан на использовании F -рецепторов, имеющихся на поверхности выращиваемых в культуре человеческих или мышиных макрофагов [10]. Вирус, не адсорбировавшийся на клеточной поверхности, может проникнуть в цитоплазму в результате образования комплексов с вирус-специ-фическими антителами. Комплексы антиген антитело связываются с F -рецепторами, и в результате этого повышается инфекционность вирусного препарата. Использование этого явления особенно полезно при работе с моноклональными антителами, так как удается идентифицировать антитела, реагирующие с поверхностью вириона. С помощью этого метода можно получить данные трех типов о повышении инфекционности вируса в присутствии антител, о титре нейтрализующих антител и о стандартной инфекционности вируса. Многие тогавирусы размножаются в макрофагах мыши (линия Р388 D1), имеющих на поверхности F -рецепторы. Эти клетки хорошо прикрепляются к поверхности культуральных сосудов, поэтому с ними можно работать, как с обычными культурами клеток. [c.89]

Все тогавирусы агглютинируют эритроциты различного происхождения, хотя конкретные условия проведения гемагглютинации (ГА) неодинаковы для разных вирусов. Чаще всего используют эритроциты гусей или цыплят, поскольку с ними реакция наиболее чувствительна. Титрование неохарактеризован-ного вируса проводят при нескольких значениях pH. После того как оптимум pH определен, в дальнейшем гемагглютинацию проводят при этом значении. [c.91]

Белки. В качестве радиоактивной метки для белков чаще всего используют [ S]-метионин, поскольку он обладает высокой удельной радиоактивностью и относительно недорого стоит. Чтобы пометить белки тогавирусов, метионин используют в концентрации 5—50 мкКи/мл. Для мечения белков, не содержащих метионина, используют [ S]-цистеин, удельная активность которого такая же, как [ S]-метионина. Можно также использовать смесь [Ш]-аминокислот. Обычно меченые аминокислоты используют в сочетании со средой, не содержащей данных аминокислот такие среды имеются в продаже. Более удобный альтернативный подход состоит в том, что кратковременное (несколько часов или менее) мечение проводят в буферном растворе, например в растворе Хэнкса, содержащем 20 мМ HEPES в качестве буфера, 2% диализованной сыворотки крупного рогатого скота или 0,1% БСА. [c.97]

Из относительно небольшого объема культуральной жидкости вирус можно сконцентрировать ультрацентрифугированием. Обычно тогавирусы осаждают центрифугированием при 50 000 g в течение 2 ч. Можно использовать как угловые роторы, так и бакет-роторы в зависимости от объема материала и имеющегося оборудования. Пробирки для угловых роторов следует тщательно закрывать, лучше всего термическим способом, предложенным фирмой Be kman. [c.98]

Вместо непосредственного ультрацентрифугирования вирус можно осадить центрйфугированием при меньшей скорости после добавления ПЭГ. Преципитация обычно ускоряется при добавлении Na l вместе с ПЭГ. Этот метод в общем более удобен при работе с большими объемами содержащей вирус жидкости, так как вместительные роторы для относительно низкоскоростного центрифугирования намного более доступны для большинства лабораторий, чем такие же роторы для ультрацентрифугирования. Кроме того, этот метод более мягкий и обычно приводит к меньшим потерям инфекционности, чем непосредственное ультрацентрифугирование. Описанная ниже методика пригодна для концентрирования некоторых тогавирусов (и других оболочечных вирусов), причем используемые концентрации Na l и ПЭГ, по-видимому, не имеют принципиального значения, однако в конкретных случаях для оптимизации выхода вируса могут потребоваться отдельные модификации. [c.99]

Минимальную концентрацию сахарозы подбирают таким образом, чтобы плотность соответствующего раствора была выше плавучей плотности вируса при этом вирус проходит через верхний слой раствора сахарозы, обгоняя медленно седименти-рующие частицы, и образует узкую зону на границе слоев с различной концентрацией сахарозы. При работе с тогавирусами в качестве верхнего и нижнего слоев используют соответственно 20%-ный и 50%-ный (вес на вес) растворы сахарозы в GTNE. В центрифужную пробирку вносят около 1/10 объема 50%-ного раствора сахарозы и осторожно наслаивают сверху [c.100]

Зональное центрифугирование лучше всего проводить в бакет-роторах или вертикальных роторах, чтобы избежать нежелательного взаимодействия материала со стенками пробирки. Линейные градиенты сахарозы (5—20%, вес на вес) готовят одним из стандартных методов (см. гл. 1, разд. 2.5.1) и сверху осторожно наслаивают раствор вируса. Поскольку при использовании данного метода отсутствует эффект концентрирования в результате образования зоны с соответствующей плавучей плотностью, объем образца не должен превышать 1/10 объема градиента. Центрифугирование следует проводить при 4°С. Время и скорость центрифугирования во многом зависят от геометрии используемого ротора, поэтому можно дать лишь самые приблизительные указания относительно режима. Первоначально используемый режим центрифугирования обычно приходится модифицировать после первых опытов с учетом полученных результатов. В бакет-роторе, например SW27, центрифугирование в течение 2 ч при 27 ООО об/мин позволяет получить достаточную степень очистки большинства тогавирусов. [c.101]

Для изопикнического центрифугирования большинства тогавирусов подходят 20—50%-ные (вес на вес) непрерывные линейные градиенты концентрации сахарозы. В комбинированных градиентах глицерина — тартрата калия [14] верхнюю (менее плотную) часть образует 30%-ный (вес на вес) раствор глицерина в 50 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА (pH 7,5), а нижнюю (более плотную)—50%-ный (вес на вес) раствор тартрата калия. pH раствора тартрата калия не должен быть ниже 8,5, так как при более кислых значениях образуется осадок. Из этих растворов обычными способами готовят линейные градиенты. Поскольку в таких градиентах вирус концентрируется в зоне с со- [c.101]

Лучший метод, позволяющий определить степень чистоты препаратов тогавирусов, — это электрофорез структурных белков в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na. Исследованные до сих пор альфа- и флавивирусы имеют небольшое число структурных белков характерного размера, образующих при электрофорезе в геле уникальный набор. Вирионы альфавирусов содержат нуклеокапсидный белок с мол. массой 30— 35 кД и 2 более крупных гликопротеина оболочки (в некоторых случаях они не разделяются при электрофорезе) с мол. массами 45—55 кД. Вирионы флавивирусов содержат белок оболочки, обычно гликозилированный, с мол. массой 50—55<кД и 2 более мелких внутренних структурных белка с мол. массами 15 и 7 кД. [c.104]

Выделение и культивирование тогавирусов не представляет принципиальных трудностей благодаря значительному разнообразию возможных экспериментальных систем. Для молекулярно-биологических исследований, как правило, необходим вирус в очень высоком титре. В случае альфавирусов подобные титры можно получить на культуре клеток. С другой стороны, многие флавивирусы дают в культуре более низкие титры, и это может потребовать соответствующей модификации условий эксперимента. Например, относительно высокой множественности инфекции достигают, выращивая клетки в виде монослоя на поверхности небольших культуральных сосудов. [c.105]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология