Радиоактивное мечение вируса

После того как зараженная клеточная культура подвергается дифференциальному центрифугированию или какой-либо другой процедуре фракционирования, необходимо идентифицировать фракции, содержащие нужный материал. При необходимости можно использовать методы, описанные в разд. 4.1 и 4.2, но они требуют довольно много времени альтернативные подходы состоят в том, что во фракциях градиента по поглощению в ультрафиолете идентифицируют пики РНК или белка. или же в материал, подвергаемый очистке, включают в качестве маркера радиоактивно меченный вирус. Затем в аликвотах из каждой фракции любым стандартным методом (например, с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика) можно определить радиоактивность. Если есть возможность получить радиоактивно меченный материал, данный метод очень удобен, поскольку он занимает мало времени, точен и прост в исполнении. [c.57]

Культивирование тогавирусов уже детально рассмотрено в одном из предыдущих разделов настоящей главы. Оптимальную систему для культивирования следует подбирать специально в каждом случае. В целом лучшей можно считать ту систему, в( которой вирус дает максимальный титр, хотя нужна иметь в виду, что очистка вируса из тканей зараженных животных, например экстрактов мозга, затруднена в связи с большим содержанием в препаратах клеточных компонентов кроме того, радиоактивное мечение вируса в организме животных, как правило, невозможно. В тех случаях, когда вирус хорошо размножается в культуре ткани, имеет смысл потратить некоторое время, чтобы оптимизировать его выход. Выбор же таких параметров, как чувствительная линия клеток, культуральная среда, множественность инфекции, температура инкубации и время сбора вируса, существенно влияет на выход. При опти- [c.95]

Очищенный радиоактивно меченный вирус получают, как описано в разд. 3.5,1 (вирус метят по РНК, используя [ Н] Ури-дин или РНК экстрагируют фенолом и далее из водной [c.151]

Радиоактивное мечение вируса [c.194]

Определение величины 5 при помощи препаративного метода в градиенте плотности, как правило, отличается меньшей точностью по сравнению с данными, получаемыми в аналитической ультрацентрифуге. Последняя, однако, не всегда доступна, к тому же иногда требуется знание коэффициента седиментации именно в условиях препаративного эксперимента. Так, например, если исследуемый материал имеется в таком количестве, которое можно обнаружить лишь по радиоактивной метке (например, меченые вирусы животных или выделенная из них РНК), то его седиментационные свойства можно исследовать только при помощи препаративного метода. Значения 20, т различных частиц приведены на фиг. 18. [c.69]

Лучший радиоактивный предшественник для введения метки в белки вируса гриппа — [ 5]-метионин. Если необходимо получить меченые вирионы, клетки перед заражением следует в течение ночи инкубировать в среде без метионина, чтобы обеспечить максимально эффективное включение метки. После заражения к клеткам добавляют среду, содержащую 200 мкКи/мл [ Sj-метионина, и через 24 ч после заражения собирают меченый вирус. [c.195]

Многие авторы измеряют плотность непосредственно в отдельных фракциях. При взвешивании на микровесах, особенно маленьких фракций, можно допустить значительные погрешности. Поэтому обычно определяют оптический показатель преломления п с помощью рефрактометра. Этот показатель можно замерить выборочно в 6—8 фракциях. Место локализации вирусных частиц определяют проверкой биологической активности во фракциях (дяя неочищенного вируса), измерением оптической плотности (для очищенного вируса) или радиоактивности (для меченого вируса). При определении значения п плотность раствора р вычисляют до формуле [866] [c.64]

Дальнейшие данные были получены с помощью актиномицина D [126]. РНК, экстрагированная из асцитных опухолей Кребс II и отцентрифугированная затем в сахарозном градиенте, образует три пика, поглощающих при 256 ммп. При идентификации оказалось, что пики эти соответствуют РНК с константами седиментации 30S, 19S и 4S. Если клетки в течение короткого времени (20 мин) инкубировать с уридином, меченным тритием, то радиоактивность обнаружится только в двух пиках меньшая — в пике 4S-PHK (растворимая РНК) и большая — в очень небольшом пике 40S-PHK. Обычные клетки и клетки, зараженные вирусом ЕМС, дают аналогичные результаты. При более длительной инкубации (2 час) радиоактивность находят не только в пике 40S-PHK, но и в трех пиках, поглощающих в ультрафиолете. Такая же картина наблюдается в зараженных клетках. [c.247]

В последнее время с помощью метода меченых атомов мы начали получать ответы на эти вопросы. Если пометить радиоактивным изотопом вещество вируса или среду, в которой он размножается, то можно следить за этими веществами и наблюдать процессы, приводящие к образованию нового вируса. В этой статье мы расскажем вам о некоторых таких опытах и о фактах, с их помощью установленных. [c.138]

Скажем сначала несколько слов о самом методе меченых атомов. Допустим, мы хотим пометить ДНК — кислотную часть вирусных частиц. Так как важной составной частью ДНК являются фосфатные группы, то мы пометим их радиоактивным изотопом фосфора — фосфором 32. Начнем мы со среды, в которой выращиваются бактерии, подлежащие заражению вирусом. В качестве источника фосфора культура содержит неорганический фосфат. К этой среде мы добавим немного радиоактивного фосфора так, чтобы на каждый миллиард атомов обычного, нерадиоактивного фосфора приходился один атом радиоактивного. Бактерии будут поглощать радиоактивный и обычный фосфор в той же самой пропорции. Теперь мы сможем сказать, сколько фосфора содержится в бактериях, если просто посчитаем радиоактивные атомы при помощи счетчика Гейгера общее количество фосфора будет в миллиард раз больше. [c.139]

Рис. 27-7. Общая схема эксперимента Херши и Чейз. Эксперимент проводили на двух препаратах бактериофага, меченного радиоактивным изотопом. В одном из ник о помощью изотопа Р были помечены фосфатные группы фаговой ДНК, а в другом изотоп был введен в серусодержащие аминокислоты белка оболочки фага. Каждый из меченных таким способом фагов по отдельности был добавлен к суспензии немеченых бактерий. Затем обе группы зараженных фагом бактериальных клеток встряхивали в смесителе. Оказалось, что клетки, зараженные Р-вирусными частицами, содержат в своем составе Р, т. е. в них попала меченая вирусная ДНК. Отделенные от клеток тени фага (пустые оболочки вируса) радиоактивности не содержали, В клетках, зараженных З-вирусными частицами, радиоактивности яе было, зато она была найдена в тенях фага после отделения их от клеток с помошью смесителя. Поскольку в обоих случаях было получено потомство вирусных частиц, данный эксперимент доказал, что генетическая информация, необходимая для репликации вируса, переносится вирусной ДНК, а не вирусным белком.

Если растение, зараженное мозаичным табачным вирусом, растет в среде с меченым фосфатом, то через несколько дней около /д усвоенного радиоактивного фосфора переходит в вирус, хотя последний содержит лишь небольшую долю всего фосфора в растении. Это связано с тем, что вирус развивается быстрее, чем заключающее его растение. [c.322]

Рис. 2.4. Примеры фракционирования градиентов, содержащих радиоактивно меченный вирус, с помощью устройства, показанного на рис. 2.3. а — меченный f 5S]-метионином вирус, фракционирование градиента с помощью устройства типа (а) (фракции по 2 мл) б — меченный Р вирус, фракционирование градиента с помощью устройства типа (б) (фракции по 2 мл) в — меченный 35S]-метионином вирус, фракционирование с помощью устройства типа (е) фракции по 0,5 мл). По оси абсцисс отложены номера фракций, а по оси ординат —радиоактивность в 50 мкл, выраженная в имп./мин-10 . Направление центрифугирования во всех случаях справа налево данные для верхних фракций градиентов не приведены. А — пик инфекционных вирионов (160S) В — пик пустых капсидов (80S) С — пик неинфекционных РНК-со-держащих частиц (130S)

Поскольку обычно работа ведется с большими объемами жидкости (более 1 л), для ультрацентрифугирования необходимо иметь роторы большой емкости. Существуют роторы емкостью 1—2 л, в которых можно осадить вирус гриппа при 50 ООО g в течение 90 мин при работе с небольшими объемами радиоактивно меченного вируса время центрифугирования можно сократить до 30 мин и проводить осаждение в роторе меньшей емкости при 200 000 g. Супернатант по возможности полностью удаляют и ресуспендируют осадок вируса в малом объеме буфера NTE с помощью шприца и иглы с широким просветом (тип 19G). Для разрушения вирусных агрегатов полученную супензию пропускают несколько раз через тонкую иглу (25G) или обрабатывают ультразвуком 1 мин. Объем NTE, в котором ресуспендируют осадок вируса, зависит от величины осадка и от того, какой объем можно использовать на последующих стадиях очистки. Обычно осадок из 1—2 л содержащей вирус жидкости ресуспендируют в 2—5 мл NTE. [c.183]

Этот быстрый одностадийный метод используют при работе с малыми объемами содержащей вирус жидкости, например в случае радиоактивно меченного вируса. Его можно использовать и для предварительной очистки вируса, сконцентриро-ваванного из большого объема жидкости. Содержащую вирус жидкость, например культуральную среду, наносят на ступенчатый градиент, состоящий из 5 мл 15%-ного раствора сахарозы в NTE (верхний слой) и 5 мл 60%-ного раствора сахарозы (нижний слой, или подушка). Градиент центрифугируют 30 мин [c.184]

Обычно исследуют присоединение ненасыщающего количества радиоактивно меченного вируса в присутствии избытка немеченых вирионов. Например, избыток полиовируса типа 1 блокирует присоединение полиовирусов типов 1, 2 и 3, но не вирусов Коксаки А21 и В1—6 и риновирусов человека типов 2 и 14. [c.218]

ДНК мышей, несущ,их в качестве трансгена фрагмент ДНК вируса SV-40, который не обнаруживает гомологии с мышиной ДНК. Исследовали потомков (А, В и С) гетерозиготных по трансгену родителей (их гетерозиготность считается генетически установленной). Два одинаковых фильтра с ДНК из тканей хвоста гибридизовали один — с радиоактивно меченной ДНК SV-40, чтобы выявить трансген, а другой — с радиоактивно меченной мышиной последовательностью, в данном случае с геном -fos. Одинаковая интенсивность гибридизационного сигнала с зондом -fos для всех трех образцов указывает на то, что количество ДНК на фильтре в каждом случае одинаково. Тогда гибридизация с зондом SV-40 позволяет сделать вывод, что мышь А имеет в геноме больше трансгенных последовательностей, чем особи В и С. Количественное денситометрическое сканирование или просчитывание радиоактивных пятен на сцин-тилляционном счетчике показало, что в геномной ДНК А содержится в два раза больше вирусной ДНК, чем в ДНК В и С, и, следовательно, особь А можно считать потенциально гомозиготной по трансгену. Этот вывод подтверждается результатами генетического анализа. Мышь А (это самец) скрестили с нормальной самкой F1 и ДНК родившихся детенышей исследовали с помощью слот-анализа. Поскольку все 10 мышей оказались гетерозиготными по трансгену, их отец (мышь А) гомозиготен. [c.349]

Установление точек действия различных рестриктаз позволяет проводить физическое картирование участков молекулы ДНК и небольших геномов (плазмид вирусов). Распределение сайтов рестрикции представляет собой своеобразный паспорт каждого фрагмента ДНК и может быть использовано для его идентификации. Принцип рестрикционного картирования сводится к получению перекрывающихся по размеру фрагментов, которые разделяют при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Молекулярную массу фрагментов обычно определяют, используя в качестве свидетеля ДНК известного размера. На электрофо-реграмме рестрикты-фрагменты ДНК различают, окрашивая их бромистым этидием и просматривая гель в ультрафиолетовом свете. Применяют также радиоактивное мечение концов фрагментов с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. [c.283]

Вскоре после заражения подавляется и синтез клеточных белков. В случае клеток HeLa, зараженных полиовирусом (эта система изучена наиболее полно), выключение происходит довольно быстро, в течение примерно 0,5 ч именно такое время необходимо для присоединения вируса к клетке, проникновения в нее и раздевания (рис. 18.11). Уровень белкового синтеза, за изменением которого следили по включению радиоактивно меченных аминокислот в кислотонерастворимый материал, достигает минимума примерно через 2 ч после заражения. Далее следует волна включения метки, достигающая максимума примерно через 3 ч она отвечает синтезу исключительно вирусных белков. Окрашивание зараженных клеток флуоресцирующими антителами к белкам капсида выявляет вирусные белки в цитоплазме — сначала вблизи ядра, затем по всей цитоплазме и в скоплениях около плазматической мембраны [124]. Наконец, начинается снижение синтеза вирусных белков, связанное с выходом внутриклеточных компонентов и гибелью клетки. [c.224]

В принципе суспензии живых, но пе делящихся клеток обесхгечинают экспериментатору ряд преимуш,еств при изучении репликации вирусов однако на практике действительно эффективной системы такого рода до сих пор предложено ие было. Можно использовать также разобщенные клетки из ткаии каллюса, растущие в культуре, или клетки листьев, разделенные ферментативной обработкой [1972]. Включение радиоактивных предшественников в ВТМ исследовалось на группах клеток из листьев [300]. С этой целью инфицированные листья измельчали при контролируемых условиях так, чтобы от 30 до 50% клеток оставались интактиыми. В этих гомогенатах синтезировался меченый вирус. Изменения, вызываемые в к.петках гомогенизацией, вероятно, довольно серьезны, однако они не были изучены. [c.136]

Вначале они поместили вирусы в культуры бактерий, убитые нагреванием. Вирусы прикреплялись к мертвым бактериям и, по-видимому, выпускали свою ДНК в раствор, так как ДНК (меченная радиоактивным фосфором) легко разрушалась ферментом дезоксирибону- [c.140]

Что происходит с белковой оболочкой вируса после того, как он выпустил свою ДНК в бактерию Херши и Чейз заражали живых бактерий вирусом, но на этот раз метили радиоактивной серой белок. Затем они встряхивали зараженных бактерий в гомогенизаторе Уорин-га — аппарате, который служит для перемешивания смесей в лаборатории. В результате встряхивания в смесителе от бактерий отделялось более 80% меченого белка. Однако это воздействие не удаляло сколько-нибудь значительного количества ДНК и не нарушало размножения вирусов внутри бактерий. Этот опыт показал, что вирусный белок остается снаружи бактерии и его функция заканчивается после того, как ДНК вошла в клетку кроме того, он позволяет считать, что ДНК скорее всего связана с размножением. [c.141]

Итак, мы узнали, что ДНК исходного заразившего вируса вызывает образование в клетке и самой ДНК и белка. Как же она осуществляет эту задачу Путнэм и Козлов метили вирусы радиоактивным фосфором и наблюдали за радиоактивностью для того, чтобы узнать, что происходит с фосфором после того, как вирусы заражают бактерии. Они нащли, что примерно 40% меченого фосфора обнаруживается в потомстве вируса, а остальное остается в среде. В опытах с радиоактивным углеродом было показано, что это относится и к другим составным частям ДНК. Другими словами, 40% ДНК исходного вируса переходит к потомкам. [c.145]

Если ДНК вируса содержит в качестве метки радиоактивный изотоп,, то вирус может инактивироваться вследствие распада включенных в него атомов. Если при этом ДНК мечена равномерно, то время, необходимое для инактивации, будет зависеть среди прочих факторов от молекулярного веса ДНК, так как он определяет число радиоактивных атомов на молекулу. Херши и др. [42] проанализировали эту задачу для случая ДНК, равномерно меченной Они установили, что скорость инактивации выра- кается следующим образом [c.238]

Введение радиоактивных изотопов в белки и вирусы, представляющее собой весьма интересную и непрерывно расширяющуюся область исследования, здесь, строго говоря, не рассматривается, так как в данном случае происходит простая замена обычного атома меченым. Однако особого внимания заслуживают химические способы введения радиоактивных заместителей, например при приготовлении имритсульфонов, содержащих S35, и белков, иодируемых J131 или фосфоршшруемых р32. [c.271]

При изучении реакций карбоангидридов аминокислот с белками ряд исследователей применяли меченные радиоактивным углеродом соединения. Френкель-Конрат [343] вводил меченный карбоангидролей-цин в реакции с белками, растворенными в смесях диоксана с фосфатным буфером. На основании опытов с вирусом табачной мозаики, инсулином, лизоцимом, яичным альбумином, бычьим сывороточным альбумином, овомукоидом и кональбумином Френкель-Конрат пришел к выводу, что [c.425]

Нативные молекулы ДНК очень велики и при экстракции из клеток обычно разрываются в результате физических или ферментативных воздействий. Мезелсон и Сталь в своих экспериментах по репликации ДНК Е. соН имели дело со сравнительно небольшими фрагментами ДНК, и полученные ими результаты относятся только к состоянию ДНК, предшествовавшему репликации и после нее. Полная репликация хромосомы Е. соН впервые наблюдалась Джоном Кейрнсом. Он разработал метод очень мягкого разрушения клеток Е. соИ. В результате Кейрнсу удалось вьщелить интактные хромосомы Е. соН и пометить их радиоактивным Н-тимидином. Меченые хромосомы аккуратно переносили из раствора на твердую поверхность, которая затем покрывалась в темноте фотографической эмульсией и в течение нескольких недель экспонировалась. В это время электроны, испускаемые радиоактивной ДНК, вызывали образование зерен серебра в фотоэмульсии вдоль молекул ДНК. Последующая обработка эмульсии дает радиоавтограф хромосомы, на котором цепочка зерен серебра отслеживает конформацию молекулы ДНК. Применение метода радиоавтографии привело прежде всего к установлению того факта, что ДНК Е. соН имеет кольцевую форму (рис. 4.22). Впоследствии было показано, что такую же форму имеет ДНК всех прокариотических организмов, а также вирусов и органелл эукариотических организмов. [c.120]

Во второй системе у реассортантных вирусов, полученных после смешанной инфекции, вызванной родительскими вирусами с хорошо различимыми фенотипами, определяли происхождение каждого сегмента РНК с последующим изучением в соответствующей клеточной системе с целью определения сегмента (или сег-.ментов) РНК вирулентного родительского вируса, обусловливающего вирулентность. Методы, используемые для генотипирования реассортантных вирусов, более детально описаны в главе 4, вклЮ чая сравнение родительских и реассортантных вирусов в отношении нескольких параметров — характера миграции РНК в ПААГ [37] белкового спектра, выявляемого в ПААГ [38] олигонуклеотидного строения отдельных сегментов РНК [64] прямой молекулярной гибридизации кРНК с меченными радиоактивными веществами отдельными сегментами вирионной РНК [45] и конкурентной гибридизации, при которой сегменты РНК исследуемых вирусов использовали для конкуренции при связывании меченой вРНК и кРНК [6]. [c.298]

Выбор методики получения вирусного препарата определяется целью дальнейшего исследования. Для изучения круга хозяев, серологических свойств, а также в качестве инфекционного материала можно использовать и неочищенные препараты вируса [2]. В качестве антигена или иммуногена [3], для клонирования и секвенирования вирусной РНК [4] и получения матричной РНК (мРНК), транслируемой в бесклеточных системах, необходимо иметь высокоочищенный вирус, не содержащий контаминантов клеточного или другого происхождения. Для изучения цикла репродукции вируса в зараженной клетке, характеристики полиовируса методом олигонуклеотидного картирования РНК [6, 7], анализа вирионных белков [8] и в ряде иммунологических исследований [9] применяют вирус, меченный радиоактивным изотопом. [c.44]

Смотреть страницы где упоминается термин Радиоактивное мечение вируса: [c.96] [c.103] [c.126] [c.67] [c.116] [c.33] [c.124] [c.897] [c.141] [c.331] [c.74] [c.98] [c.172] [c.208] [c.209] [c.218] [c.32] [c.84] [c.184] [c.96]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология