Олигонуклеотиды уникальны

При гидролизе РНК вируса табачной мозаики действием гуанил-РНК-азы удалось выделить три длинных олигонуклеотида уникальной последовательности для локализации их положения в молекуле РНК использован прием частичной депротеинизации РНК фага. Известно, что депротеинизация фаговой РНК под действием додецилсульфата происходит последовательно, начиная с 5 -конца цепи PHK s. Прерывая процесс депротеинизации в разные моменты времени и расщепляя освободившуюся РНК, можно определить относительное расположение различных фрагментов. [c.81]

Уникальный для данного локуса олигонуклеотид, который может использоваться для его идентификации методом ПЦР. [c.548]

Известная специфичность ферментов позволяет воссоздать некоторые частичные последовательности полинуклеотидной цепи. Далее проводят расщепление исходного полинуклеотида на более крупные блоки (чаще всего для этой цели применяют частичный гидролиз гуанил-РНК-азой) и отыскивают в них участки нуклеотидных последовательностей, позволяющие однозначно расставить в полинуклеотидной цепи фрагменты, полученные ранее, и воссоздать таким образом полную структуру полинуклеотида. Существенным моментом для успеха такой реконструкции является присутствие в нуклеотидной последовательности уникальных участков, которые могут быть использованы как отправные точки. Для этой цели можно использовать концевые группы, а также редкие компоненты или олигонуклеотиды, встречающиеся в продуктах ферментативного гидролиза полинуклеотида только один раз. [c.73]

С другой стороны, в случае удачных замещений ( N замешается только на А, и или С, а R на А ) можно обнаружить более 17 последовательностей, содержащих 9 и более оснований и лишь один, концевой, остаток О, Из табл. 8.2 видно, что две гипотетические последовательности содержат по 21 основанию, три - по 17, а две другие -соответственно 16 и 15 оснований. Разумеется, возможны и промежуточные варианты, когда длинные, например 21-членные, олигонуклеотиды оказываются более короткими, но все еще содержащими более 15 оснований. Если какой-либо из этих гипотетических олигонуклеотидов действительно образуется при Т i -РНК-азном гидролизе РНК фага R17, то вероятность того, что он окажется структурно уникальным и его легко можно отделить от других олигонуклеотидов, должна быть довольно высокой. Проведя гидролиз РНК фага R17 Т -РНК-азой, целесообразно [c.157]

Небольшие делеции в окрестностях сайтов рестрикции можно получать быстрее удалением липких концов линеаризованной плазмидной ДНК после рестрикции с последующим замыканием линейной ДНК в кольцо лигированием по образовавшимся тупым концам. В этом случае размер делеции соответствует размеру одноцепочечных липких концов в сайтах рестрикции. Кроме того, такой метод допускает простую проверку наличия мутаций в требуемом участке ДНК, так как в результате мутации происходит потеря уникального сайта рестрикции. Для получения вставок коротких или протяженных последовательностей нуклеотидов в исследуемые участки клонируемых генов также разработаны эффективные и надежные методы. В простейшем случае такая задача решается путем расщепления исследуемого гена рестриктазой по уникальному сайту рестрикции и встраивания по этому сайту фрагмента природной ДНК или синтетического двухцепочечного олигонуклеотида, который фланкирован соответствующими липкими концами. Лигирование может проводиться и по тупым концам. В таком случае последовательности нуклеотидов на концах вставки уже не имеют существенного значения для встраивания этого фрагмента по сайту рестрикции. [c.289]

Расчеты показывают, что для специфичного связывания с геном в геноме, иап(жмер для бактериофага >., достаточна длина 12 нуклеотидных звеньев, последовательность 15 звеньев идентифицирует уникальный ген в дрожжевом геноме, а 18—20-членные олигонуклеотиды используют для поиска генов в банке генов млекопитающих. [c.379]

К настоящему времени сделаны базисные разработки для выращивания клеток млекопитающих и есть все основания надеяться на то, что аппаратурное оформление биотехнологических процессов будет постоянно совершенствоваться. Как пример сказанному можно назвать геновый ассемблер, с помощью которого синтезируют олигонуклеотидные последовательности ДНК длиной около 200 оснований. Олигонуклеотиды "растут на твердых бусинках, помещенных в специальные кассеты, имеющие цветовой код (А/О Фармация, ЛКБ-приборы, Швеция). С применением уникальной кассетной системы (объемом О, 2, 1, 3 или 10 микромолей) исключается необходимость взвешивания матрицы перед [c.348]

Попытаемся теперь пояснить смысл наблюдаемой константы скорости ренатурации второго порядка к2- Описанные ранее исследования олигонуклеотидов показывают, что для возникновения зародыша двойной спирали необходимо образование более чем одной пары оснований. Обшее число участков нуклеации для цепи ДНК длиной Т составляет /37", где /3 — плотность участков нуклеации, т.е. среднее число участков в расчете на один нуклеотид (так что /3 1). Для ДНК с повторами общее число различающихся участков нуклеации равно /ЗЛ . Для изолированных цепей, разрезанных одинаковым образом на фрагменты длиной L с полной концентрацией нуклеотидов, равной Со, начальная концентрация любого уникального участка нуклеации равна пС /ТГ = Сд/2Х . (Для случайной фрагментации ДНК см. Дополнение 23.1.) [c.352]

Обратная трансляция аминокислотной последовательности Met-Phe-Asn- ys-Trp указывает на необходимость синтеза 15-звенного вырожденного олигонуклеотида со следующей первичной структурой ATGTT(T/ )AA(T/ )TG(T/ )TGG, в которой нуклеотиды в скобках отмечают места с неоднозначной последовательностью. Теоретически олигонуклеотид длиной в 14-15 нуклеотидов, полученный путем обратной трансляции последовательности из пяти аминокислотных остатков должен быть уникальным для геномов такого размера, как геном человека. Впрочем, это утверждение верно лишь в том случае, если геном представлен случайной последовательностью. На практике это не так. В любом большом геноме встречаются мультигенные семейства с близкой первичной структурой, и наблюдается гомология между многими последовательностями, которая отражает их зависимое друг от друга происхождение. Поэтому 15-звенный олигонуклеотид при исследовании генома человека скорее всего не окажется геноспецифическим. Однако извлечь специфическую геномную последовательность с помощью таких олигонуклеотидов можно при использовании их в качестве праймеров для ПЦР на матрице кДНК соответствующей клонотеки. В этом случае неспецифические олигонуклеотиды скорее всего не будут участвовать в образовании продукта ПЦР. [c.165]

З -Концевая часть олигонуклеотида Скорпион заключает в себе последовательность, комплементарную анализируемому участку ДНК, и в ПЦР выполняет непосредственную роль праймера. 5 -Концевая часть олигонуклеотида сконструирована таким образом, что образует структуру типа стебель-петля . За счет этого происходит сближение флуорофора, присоединенного непосредственно к 5 -концу Скорпиона с тушителем флуоресценции, расположенным в центральной части олигонуклеотида на границе последовательности праймера. В этом отношении пространственная структура олигонуклеотидов Скорпион напоминает таковую молекулярных маяков и выполняет ту же функцию - обеспечивает тушение флуоресценции флуорофора до тех пор, пока олигонуклеотиды находятся в свободном состоянии. Однако, в отличие от молекулярных маяков , участок ДНК, находящийся в петле Скорпиона , комплементарен последовательности нуклеотидов амплифицируемой последовательности ДНК (ампликона), что и обеспечивает ему уникальные свойства. Кроме того, непосредственно за тушителем флуоресценции в цепь ДНК вводится мономер гексэтиленгликоля (HEG), который блокирует прохождение ДНК-полимеразы вдоль матрицы до 5 -конца, т.е. прекращает амплификацию в этой точке, и последовательность, образующая структуру типа стебель-петля , остается неамплифицированной. [c.231]

Еще одним широко распространенным способом отбора молекул ДНК - потомков мутантной цепи плазмидной ДНК является расщепление двухцепочечных молекул плазмидной ДНК, полученных на матрице родительской немутантной цепи, по уникальному сайту рестрикции, который элиминируется в мутантной цепи вторым олигонуклеотидом [20]. Этапы реализации этого подхода в общих чертах совпадают с вышеописанными для (3-лактамазы. [c.292]

При реализации такого подхода из гена, клонированного в составе векторной плазмиды, по двум близко расположенным уникальным сайтам рестрикции вырезается фрагмент ДНК, в который требуется внести мутации, и на его место встраивается синтетический двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий необходимые замены нуклеотидов (кассету мутаций). В этом случае, если в окрестностях мутагенизируемого локуса гена отсутствуют подходящие природные сайты рестрикции, их вводят с помощью направленного мутагенеза. Разработка автоматических синтезаторов ДНК сделала синтез олигодезоксирибонук-леотидов простой и даже рутинной процедурой. Более того, использование на некоторых этапах синтеза вместо одного нуклеотида смеси из двух, трех или даже всех четырех дезоксирибо-нуклеозидтрифосфатов позволяет получать за один прием сложную смесь олигонуклеотидов, которые могут содержать в определенных сайтах наборы кодонов для многих или даже всех 20 природных аминокислот. Это дает возможность осуществлять одновременный скрининг по искомому мутантному фенотипу большого числа разных мутантных клонов, полученных в одном цикле клонирования. С помощью кассетного мутагенеза можно определять функциональную роль отдельных сайтов и целых доменов в полипептидных цепях конкретных белков и создавать рекомбинантные белки с новыми, подчас неожиданными свойствами. [c.323]

Генетическая основа очень редкого увеличения вирулентности вакцинных штаммов вируса полиомиелита во время его репликации in vivo неизвестна [204]. В случае вируса типа 3 в кишечнике вакцинированных может наблюдаться сдвиг в сторону более высокого уровня вирулентности для ЦНС обезьян, однако пока значение таких изменений не выяснено. Они широко распространены, но связанный с вакцинацией паралич встречается чрезвычайно редко [116, 198]. Информация о мутациях, развивающихся во время репликации вакцинного вируса в организме индивидуума с бессимптомной инфекцией или параличом, скудна. Было проанализировано пять изолятов — четыре от больных с параличом, связанным с вакцинацией (два вирусом полиомиелита типа 1 и два типа 3), и один от вакцинированного, у которого полиомиелит (типа 1) не развился. Карты больших олигонуклеотидов этих изолятов (представляющих 10 % вирусного генома) сравнивали с соответствующими картами родительских вакцинных штаммов [135]. На основании этих исследований было установлено, что четыре изолята из пяти обследованных (три типа 1 и один типа 3) претерпели от 40 до 70 мутаций [135]. Картина мутаций изолятов типа 1 была уникальной для каждого вируса. Интересно, что олиго-нуклеотидная карта одного из вирусов типа 3, выделенного из спинного мозга больного бульбарным полиомиелитом, не отличалась от соответствующей карты вакцинного вируса [135]. Полученные данные позволяют предположить, что этот вирус претерпел менее 10 мутаций. Таким образом, для восстановления вирулентности требуется всего несколько мутаций в соответствующей зоне. Похоже, что многие мутации, обнаруженные в других изолятах, были молчащими в отношении нейровирулентности. [c.167]

Исходя из теории вероятности встречаемости отдельных участков нуклеотидной последовательности разной протяженности в ДНК, можно считать, что уже 15-мерный праймер будет (при условии его 100%-ной гомологии с мишенью) уникальным для генома человека, оцениваемого обычно в 3 X 10 пн. Вторым условием является непринадлежность данного олигонуклеотида к каким-либо повторяющимся элементам генома. Таким образом, вероятность фальш-праймирования данными олигонуклеотидами такой протяженности с какого-то другого места генома крайне низка. В то же время нельзя не учитывать возможность отжига праймера с не полностью спарившимися основаниями, что как раз может привести к фальш-праймированию. Чтобы хоть как-то уменьшить вероятность этого, необходимо провести анализ уже известной последовательности секвенируемого фрагмента ДНК и самого вектора, уделяя максимальное внимание выявлению участков 1(Ю%-ной гомологии с последними 5-7 нуклеотидами праймера на его З -конце. В случае все же нечитаемого радиоавтографа геля, ввиду наличия в матрице ДНК дополнительных мест отжига праймера, повышение температуры отжига праймера теоретически может помочь преодолеть эту проблему. В противном случае необходимо синтезировать новый праймер с другой последовательностью. [c.63]

Рис. 2.16. Схема использования октамерных олигонуклеотидов в качестве уникальных праймеров для секвенирования ДНК праймерной прогулкой при помощи дифференциального удлинения данного праймера неполным набором дезоксинуклеотидтрифосфатов

Метод ПЦР обеспечивает уникальную возможность тонкого генетического анализа и изучения хромосомной рекомбинации, ДНК-поли-морфизма и др. В частности, показано, что после 50-60 циклов ПЦР, выполненных на ДНК единичных диплоидных или гаплоидных клеток человека, удается надежно определять аллельный тип анализируемого гена в гибридизационном тесте амплифицированной ДНК с аллельспеци-фичными 32р-меченными олигонуклеотидами. На лизатах индиввдуальных сперматозоидов человека продемонстрирована возможность одновременно анализировать два локуса, расположенных на негомологичных хромосомах. [c.52]

Кассетный мутагенез. Участок, в который мы хотим внести мутацию, вырезают из клонированного рекомбинантного вектора по двум фланкмрующим уникальным рестрикционным сайтам и вместо него включают синтетический дуплексный олигонуклеотид, содержа- [c.349]

В настоягцее время сугцествует сразу несколько кардинально различаюгцихся технологий изготовления ДНК-чипов, каждая из которых имеет как свои достоинства, так и недостатки. Наиболее типичный ДНК-чип представляет собой пластинку-носитель (чагце всего - стекло) плогцадью около 1 см , на которой в определенном порядке расположены ячейки, содержагцие иммобилизованные олигонуклеотиды с уникальной последовательностью оснований или какие-либо другие одноцепочечные фрагменты ДНК, причем количество ячеек может достигать 1 млн, а размер их сторон ныне обычно не превышает 10 микрон. Здесь надо сказать, что в самое последнее время в литературе стали появляться упоминания о егце только разрабатываемых наночипах, которые должны будут безусловно [c.29]

Таким образом, уже сейчас разработано несколько способов ДНК-компьютинга, основные из которых можно подразделить на генерирующие и вычитающие . К первым относятся молекулярные вычисления путем построения с помощью лигирования и амплификации правильной последовательности из олигонуклеотидов, вторые же рассчитаны на ту же амплификацию, но после удаления неправильных последовательностей из имеющегося набора путем их расщепления рестрикционными эндонуклеазами или в случае РНК -РНКазами. Общей же чертой этих разных подходов является то, что в основе данных компьютерных вычислений лежит принцип гибридизационной логики или, другими словами, уникальная способность молекул ДНК спариваться по принципу комплементарности, о которой в ходе данного повествования уже многократно говорилось. [c.48]

Смотреть страницы где упоминается термин Олигонуклеотиды уникальны: [c.90] [c.91] [c.165] [c.506] [c.379] [c.76] [c.102] [c.43] [c.103] [c.104] [c.116] [c.43] [c.218] [c.103] [c.104] [c.192] [c.103] [c.410] [c.70] [c.72] [c.480] [c.21] [c.347] [c.18] [c.56]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология