Иммунопреципитация

Принцип метода. Иммуноэлектрофорез представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с двойной диффузией и иммунопреципитацией в геле. Вслед за электрофоретическим разделением белков в агаровом геле навстречу полученным фракциям диффундирует специфическая иммунная сыворотка. Этот метод позволяет характеризовать белки не только по скорости миграции в электрическом поле, но и по антигенным свойствам. [c.137]

Рис. 4.6. Основные методы иммунопреципитации в геле.

Титр антисыворотки сильно зависит от концентрации антигена, используемого дл я тестирования и от способа его определения. Например, одна и та же сыворотка может иметь титр 100 в тесте иммунопреципитации и 100 000 в тесте иммуноферментного анализа. Поэтому при тестировании сыворотки и определении титра лучше всего применять тот же метод, что и при анализе, а концентрацию антигена выбирать близкую к минимальной в том диапазоне, который выбран для анализа. Кроме того, следует учитывать, что в иммуноферментном анализе используют как гомогенные, так и гетерогенные методы определения концентрации антигена, которые могут сильно отличаться по структуре образующихся иммунных комплексов. В частности, в твердофазных методах вероятность образования циклических комплексов антиген — антитело значительно меньше, чем в гомогенных, а следовательно, и Наблюдаемая аффинность антител в обеих системах будет разная. [c.158]

Специфичность и титр выделенных специфических антител проверяют реакцией иммунопреципитации. [c.268]

Вильямсон и Аллисон [13] сделали попытку усовершенствовать стадию иммунопреципитации с помощью метода Лорелла [63], заключающегося в проведении электрофореза антигена в гелях агарозы, включающих антитела. Согласно предложенной методике, белки после разделения переносят на полоску фильтровальной бумаги, которую затем помещают на слой агарозы с антителами, и проводят электрофорез. Таким путем в сыворотке мыши удалось обнаружить до 20 компонентов [13, 64 В другом варианте удаляют лишний сефадекс по Хансону [14 а затем осторожно переносят весь гель агарозы с антителами на полоску сефадекса. По такой методике выполнен анализ молекулярновесового распределения а-липопротеина нормальной сыворотки [65], приведенный на рис. 9. [c.275]

В данных методах совмещены электрофоретическая миграция антигенов в агарозе с последующей иммунопреципитацией в геле. В результате первого процесса происходит частичное разделение смеси антигенов, поскольку скорость их миграции в геле зависит от суммарного заряда при данном рП буферного раствора. Кроме того, отрицательно заряженные молекулы быстро мигрируют в гель, содержащий антитела, что ускоряет преципитацию и сводит к минимуму латеральную диффузию. [c.215]

Все описанные выше рекомбинантные векторы экспрессируют гликопротеид НА, который не различается во всех изученных отношениях от НА, синтезированного во время естественной гриппозной инфекции. Для установления этого положения, т. е. того факта, что синтезированное образование — подлинный по своей структуре, антигенности и биологическим активностям гликопротеид НА, были проведены серии экспериментов в клетках, инфицированных различными рекомбинантами, включаюш,ие иммунопреципитацию, иммунофлюоресценцию, гемагглютинацию и тесты слияния клеток (рис. 30). Эти эксперименты были детально описаны ранее [5, И, 24, 28] и очень коротко будут обсуждены здесь. [c.172]

При использовании аффинной хроматографии для выделения антигена из раствора используют антитела, иммобилизованные на нерастворимом носителе. При этом ключевым параметром иммуносорбции становится аффинность моновалентного взаимодействия [17]. Благодаря высокой концентрации МКА, присоединенных к гелю, связывание антигена, как правило, происходит достаточно быстро, и лишь в исключительных случаях кинетические параметры иммуносорбции требуют скорости потока меньшей, чем обычно используемая — один объем колонки в час. Выявление МКА обычно основано на поливалентном связывании с антигеном (см. рнс. 5.1), в котором участвуют как низко-, так и высокоаффинные антитела. Однако для аффинной хроматографии требуются антитела, обеспечивающие моновалентное связывание. Поэтому среди имеющихся МКА необходимо провести дополнительный отбор препаратов, обладающих нужной аффинностью. Это можно сделать, например, по способности МКА вызывать иммунопреципитацию антигена или по торможению растворимым (одновалентным) антигеном связывания с поливалентным антигеном, иммобилизованным на поверхности клеток или пластиковых панелей [17]. На рис. 5.2 схематично изображены взаимодействия, возможные при реакции торможения. Очевидно, торможение происходит лишь в том случае, если время диссоциации 50% моновалентных связей примерно равно или превышает время проведения самого анализа. Антитела, у которых 1./, составляет более 10 мин. [c.171]

При введении животному чистого белка вырабатываемые антитела специфичны только для этого белка. В таком случае получают моносиецифичную антисыворотку (см. рис. 4.2). Следует отметить, что иммунизация очищенным белком не всегда дает такой результат. Примеси, присутствующие в очищенной фракции, если они достаточно иммуногенны, могут вызвать образование антител. Чрезвычайно важно удостовериться, что антисыворотка моноспецифична до использования ее при определенных методах (в сущности, ири всех описанных здесь методах, за исключением методов иммунопреципитации в геле) это исключит возможность участия в реакции неспецифических антител. Неспецифические антитела чаще появляются при длительных процессах иммунизации. [c.96]

Этот особый аспект реакции иммунопреципитации может бь[ть охарактеризован кривой преципитации, представляющей количество осадка как функцию возрастания количества антигена, добавленного к тому же количеству антител (рис. 4.4). Количество этого осадка вначале увеличивается, проходит через максимум, называемый точкой эквивалентности, а затем умень[цает-ся. При избытке антигена часть комплекса антиген—антитело не осаждается это может быть обусловлено разной природой решетки, образованной в этих условиях (см. рис. 4.2 А). При большом избытке антигена осаждение может ингибироваться. В некоторых случаях, например с лошадиной антисывороткой, аналогичный эффект можно наблюдать не только при избытке антигена, но также при избытке антител. [c.100]

Рис. 69. Препаративное изотахофоретическое разделение белков сыворотки крови человека [280]. Л. 1 мл сыворотки компоненты идентифицированы с помощью иммунопреципитации. 1 — преальбумин 2 — орозомукоид 3 — аран-титрипсин 4 — альбумин 5 — церулоплазмин 5 — гаптоглобин 7 — трансфер-рин 8 — ое-макроглобулин Р — иммуноглобулин А (IgA) — иммуноглобулин М (1ёМ) // — иммуноглобулин О (IgG). Б. 2 мл сыворотки 1 мл 40%-ного амфолина (pH 5—7) был использован в качестве пространственного разобщителя. Регистрация поглощения УФ-света при 280 нм. Начальное напряжение 800 В со стабилизацией силы тока в 10 мА, температура 10 X, скорость элюции 25 мл/ч,

В целях определения D-антигенов используют 3 главных метода с моноклональными антителами иммунофлуоресцентный, иммуноосадочный (иммунопреципитация) и иммуногистологический на тканевых срезах. К началу 90-х годов было определено 78 D-антигенов ( D1— D78), часть из которых представлена в таблице 59. [c.567]

Сочетание иммунодиффузии с гель-фильтрацией в тонком слое представляет собой чувствительный метод, напоминающий и дополняющий иммуноэлектрофорез. Далее мы называем этот метод имм шо-гель-фильтрацией, хотя были предложены и другие термины, например, иммунохроматография [17, 53] и гелевая иммунофильтрация [54]. Известно несколько вариантов этого метода 13—15, 17, 53—55]. Грант и Эвералл [54] проводили иммунодиффузию в слое сефадекса. Хотя в цитируемых здесь работах приводятся отличные спектры иммунопреципитации, эта методика, как отмечают сами авторы, имеет ряд недостатков [56, 57]. [c.271]

Носителями в данном случае чаще всего служат ацетат целлюлозы [26] и гели агарозы [4]. Разрешающая способность таких систем очень низка из-за чрезмерного диффузионного размывания зон. Применение в качестве носителя крахмального или полиакриламидного геля значительно повышает разрешающую способность прежде всего благодаря молекулярно-ситовому эффекту. Иммуноэлектрофорез [56] является одной из разновидностей зонного электрофореза при постоянном значении pH после разделения белки диффундируют навстречу специфическим антителам и их взаимодействие приводит к образованию дуг иммунопреципитации. Полуколичественную оценку каждого антигенного компонента можно выполнить методом электроиммунодиффузии [57]. После разделения методом зонного электрофореза антигенные белки электрофоретически мигрируют в направлении, перпендикулярном прежнему пути, в гель, содержащий равномерно распределенные антитела. Высота образующихся пиков преципитации является мерой относительной концентрации белков в смеси. [c.120]

Методом иммунопреципитации белок S-100 был обнаружен и в ядрах HeiiponoB (Hyden, M Ewen, 1966). Асимметрия в распределении белка S-100 привлекает внимание при выяснении функциональной роли кислых белков. [c.138]

Очень важно установить, имеются ли в сыворотке иммунизированной мыши антитела к белкам, кодируемым вставочными последовательностями. Для этого используют ряд подходов в зависимости от того, насколько легко получить полноразмерный нативный продукт ОРС. Если известно, что ОРС экспрессируется в культивируемых клетках определенной линии или что ее продукт в достаточном количестве присутствует в определенной ткани, тогда можно определить активность сыворотки в отношении данных клеток или тканей с помощью иммуноци-тохимических методов, иммунопреципитации или вестерн-блот-анализа. По нашим данным, при работе с ОРС млекопитаю- [c.182]

На рис. 6.4 показана иммунопреципитация экстрактов инфицированных вирусом SV-40 клеток V-1 моноклональными антителами РАЬ204 (А) и мышиной антисывороткой к гибридному белку (рис. 6.4, Б). И те, и другие антитела дают специфическую иммунопреципитацию с большим Т-антигеном вируса SV-40. Это говорит о наличии иммунного ответа на инъекцию иммуногена — гибридного белка, включающего фрагмент большого Т-антигена. [c.183]

Рис. 6.4. Иммунопреципитация меченных 5-метионином экстрактов клеток СУ-1, инфицированных и псевдоинфицирован-ных вирусом 5У-40. Дорожки п —псев-доинфицированные клетки СУ-1, дорожки и — инфицированные клетки СУ-1. А — иммунопреципитация моноклональными антителами к большому Т-антигену Б — экстракты после иммунопреципитации сывороткой мыши, иммунизированной гибридным белком -галактози-даза — большой Т-антнген (аминокислоты 271—448), не взаимодействующим ни с одним из известных моноклональных антител к большому Т-антигену. Новые гибридомные клоны, продуцирующие моноклональные антитела, были получены в результате слияния с использованием спленоцитов такой мыши. (Рисунок взят из работы [9] приводится с любезного разрешения авторов.)

Моноклональные антитела могут эффективно использоваться в иммунопреципитации и в иммуноцитохимических методах. На ранних этапах наших исследований при использовании и того, и другого метода мы сталкивались с трудностями из-за повышенного фонового сигнала, который отсутствовал при использовании поликлональных антител. Нам удалось преодолеть эти затруднения в табл. 6.7 и 6.9 приводятся соответствующие методики, которые, как мы обнаружили, во многих случаях хорошо работают. [c.196]

Для идентификации Н- и К-антигенов используют моно-рецепторные сыворотки, полученные отдельно к гемагглюти-нину и нейраминидазе. При этом идентификация Н-антигена проводится в РТГА или с помощью реакции иммунопреципитации в геле, а К-антигена —в реакции ингибиции нейрамини-дазы и реакции йммунопреципитацйи в геле. [c.235]

Скуде и Джеппсон [1191] в первом направлении проводили ИЭФ в полиакриламидном геле, а антитела включали в комбинированный полиакриламидно-агарозный гель (2% полиакриламида и 0,5% агарозы), вполне пригодный для иммунопреципитации. Во время электрофореза во втором направлении необходимо было накрывать гель тонкой полимерной пленкой, чтобы предотвратить сокращение объема полиакриламидного геля. Джонсон и др. [643] проводили электрофорез в первом направлении в комбинированном геле (5% полиакриламида и 0,8% агарозы), а во втором — в агарозном геле, содержащем антитела. [c.261]

Как уже отмечалось, ацетат целлюлозы является вполне подходящей средой для иммунопреципитации, поэтому его можно использовать также для электроиммуноанализа и в меньшей степени для перекрестного иммуноэлектрофореза. Существенное различие между ацетатом целлюлозы и агарозой состоит в том, что в первом практически отсутствует электроэндосмос. В результате при pH 8,6 большинство антител будет двигаться в электрическом поле к аноду. При анализе антигенов, подвижность которых лишь ненамного превышает подвижность антител, последние будут мигрировать в сторону, противоположную от зоны нанесения антигенов, что приведет к образованию пиков преципитации, лишенных базовой линии. Чтобы свести к минимуму подвижность антител, необходимо снизить pH буферного раствора. Электроиммуноанализ альбумина был осуществлен при pH 6,5 [717], а лактоферрина — при pH 7,4 [1125]. Белки сыворотки крови, обладающие подвижностью ог и ог-глобули-нов, удалось успешно разделить при pH 8,6, но для разделения трансферрина и иммуноглобулинов пришлось снизить pH до 7,4. [c.262]

Бьеррум и Лундал [125] показали, что включение в среду различных неионных детергентов в концентрации не более 2% не влияет на иммунопреципитацию белков в агарозных гелях. [c.317]

Берзине и др. [114] методом перекрестного иммуноэлектрофореза изучали антигены из микросом печени крысы, обладающие эстеразной активностью. Солюбилизацию белков осуществляли с помощью детергентов люброла и дезоксихолата. Вначале проводили ИЭФ (pH 3—7), а затем иммуноэлектрофорез в агарозном геле, содержавшем 10% кроличьей антисыворотки к микросомам печени крысы. Эстеразы идентифицировали по ферментативной активности согласно методу Уриэля [1323] (см. гл. II.6). В эстракте, полученном с помощью детергентов, обнаружили по меньшей мере 20 зон неспецифических эстераз, большинство из которых имели ИЭТ в интервале pH 4,5—6,5. При иммуноэлектрофорезе выявлено не менее 5 полос иммунопреципитации, обладающих выраженной микрогетерогенностью. [c.318]

Лунки для антигена размещают таким образом, чтобы можно было осуществлять длительный электрофорез компонентов, мигрирующих к аноду. В лунку вносят 5 мкл сыворотки и электрофбрез проводят в течение 2 ч при напряжении 7—8 В/см. Некоторые авторы используют удлиненные стеклянные пластинки и увеличивают время электрофореза [682, 1071]. Для иммунопреципитации применяют антисыворотки с высоким титром антител или, что более предпочтительно, моноспецифические антисыворотки против группоспецифического вещества. [c.340]

При механической желтухе в плазме больных обнаруживается особый липопротеид (Lp-X), который по своей плотности принадлежит к ЛНП и обладает характерным липидным и белковым составом. Выявление Lp-X на электрофореграмме основано на его миграции к катоду при обычных условиях электрофореза в агаровом геле. Для увеличения катодной подвижности Lp-X пластины агарового геля необходимо выдерживать перед электрофорезом не менее 6 ч [990, 1166]. Надежная локализация этого белка стала возможной благодаря применению специфических антисывороток [1164]. Петек и др. [990] сравнили три различных способа проведения иммунопреципитации. При первом способе антисыворотку помещают в канавки, подобно тому как это делается при иммуноэлектрофорезе по методу Шайдеггера. Во втором способе после электрофореза в геле вырезают круглые лунки для антител на расстоянии 4 мм от лунок для антигена. В обоих случаях время, необходимое для диффузии, составляет 12—16 ч. Второй способ является более экономным с точки зрения расходования антисыворотки. При использовании третьего способа (иммунофиксация) антисыворотку прямо наносят на поверхность геля на расстоянии [c.355]

Смотреть страницы где упоминается термин Иммунопреципитация: [c.500] [c.277] [c.299] [c.186] [c.189] [c.189] [c.189] [c.206] [c.135] [c.143] [c.172] [c.173] [c.176] [c.179] [c.235] [c.260] [c.265] [c.355] [c.184] [c.186] [c.197]

Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков (1974) -- [ c.271 , c.272 , c.275 , c.277 ]

Электрофорез в разделении биологических макромолекул (1982) -- [ c.239 , c.242 , c.246 ]

Иммунология Методы исследований (1983) -- [ c.64 , c.67 , c.89 ]

Иммунология (0) -- [ c.531 , c.532 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология