Разрезание гелей

Необходимо, чтобы фрагменты разрезанного геля были одинаковых размеров. [c.202]

Помимо разделения белков по молекулярной массе электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН дает высокое разрешение и облегчает разрезание геля, поскольку ДСН при охлаждении выпадает в осадок и препятствует образованию крупных кристаллов льда. [c.225]

Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии 203, 394]. [c.244]

Рпс. 7. Приспособление для разрезания геля (вверху зу — в собранном виде). [c.111]

Нетрудно заметить, что формулы (1У.7б) и (1У.39) имеют одинаковый вид, только вместо (1У.39) в (1У.76) стоит функция Такое сходство может показаться странным, поскольку (1У.39) выведена суммированием вкладов только древесных диаграмм, а формула (1У.76) описывает гель, содержащий циклические фрагменты. Однако оно не случайно и может быть объяснено с помощью методов теории поля для систем, содержащих конденсат [180], роль которого в рассматриваемом случае играет гель. Для вычисления корреляционных функций в рамках приближения СП в таких системах рассмотрение циклической диаграммы сложной топологии, которая в термодинамическом пределе отвечает конденсату, можно заменить ее эквивалентным набором бесконечных хордовых деревьев. Последние получаются из графа путем разрезания всех его циклических ребер всевозможными способами. [c.278]

Для разрезания столбика геля в поперечном направлении предложены различные устройства [96—98]. Удобным прибором служит набор лезвий безопасной бритвы, фиксированных на двух стержнях с резьбой и отделенных друг от друга шайбами толщиной 1 мм. [c.324]

Разрезание слоев геля [c.139]

Другой метод заключается в замораживании геля на блоке сухого льда с последующим разрезанием простым приспособлением с помощью лезвия бритвы [47]. Перед замораживанием из геля необходимо удалять все вещества, способные понизить температуру замерзания. Срезы геля затем переносят в воду для размораживания (чтобы предотвратить их деформацию), а избыток влаги удаляют фильтровальной бумагой. [c.145]

Рис. 25.4. Гель-электрофорез, используемый для разделения фрагментов ДНК различной длины. Фрагменты образуются при разрезании ДНК одной или несколькими рестриктазами. Самые большие фрагменты движутся медленнее всех, так как им гораздо труднее пройти через поры в геле. На фотографии они расположены поблизости от стартовых лунок в геле.

Если 3 млрд пар нуклеотидов, входящих в состав генома человека, упаковать по правилам в одной двойной спирали, она протянется на 1,8 м. Между тем эта полоса, разрезанная на 46 хромосом, втискивается в клеточное ядро поперечником несколько нанометров (напомню 1 нм = 10" м). Конечно, в такой тесноте молекулам изрядно достается, и они слабо напоминают идеальную картинку, изображающую молекулу в безбрежном море растворителя. Плотность такой упаковки составляет около 100 мг/мл, что сопоставимо с плотностью высокопористого полимерного геля. [c.16]

Если взять определенную молекулу ДНК и обработать ее подходящим рестриктирующим ферментом, то в строго определенных местах произойдут разрывы, которые разделят ДНК на ряд отдельных фрагментов. Эти фрагменты можно фракционировать по размеру методом гель-электрофореза. Для этого препарат разрезанной ДНК наносят сверху на агарозный гель. При наложении электрического поля фрагменты начнут перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется. (Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму длины фрагмента.) [c.44]

Наиболее существенный вывод, который можно сделать из этих результатов, состоит в следующем сайт разрезания представляет собой короткий отрезок (порядка 3-4 пар оснований), в котором фосфодиэфирные связи в обеих цепях открыты для действия нуклеазы. Аналогичный вывод был сделан при детальном исследовании в гелях высокого разрешения фрагментов одной цепи с концевой меткой, полученных при разрезании минимальной нуклеосомы ДНКазой I или II. Пример такого эксперимента показан на рис. 29.15. В каждом сайте действительно существуют 3-4 положения, в которых может произойти разрез, т. е. сайт разрезания определяется с точностью +1 п. н. Относительная интенсивность разрезания указывает на то, что некоторые положения оказываются предпочтительнее других. На основе полученной картины можно подсчитать среднюю точку разрезания. При этом видно, что нуклеотидные пары сайтов от 81 до 84 лежат на расстоянии 10,0 п.н. друг от друга, сайты от 84 до 810 разделены на 10,7 п.н., а для сайтов [c.366]

Разрезание отдельных фрагментов рестрикции А рестриктазой В. Обычно при этом используется двумерный гель-электрофорез SD- фрагменты рестрикции А сначала разделяются в первом направлении, затем разрезаются рестриктазой В и получившиеся DD-фрагменты разделяются во втором направлении. Этот метод позволяет резко сократить вычислительные сложности при поиске вилок и вложений - лимитирующих этапах при построении парных карт. [c.186]

Рис. 27. Приспособление для разрезания крахмального геля на продольные

Согласно одному из таких методов [357], гель, разрезанный в продольном направлении, кладут на влажную фильтровальную бумагу, которую помещают в воронку для отсасывания с мелкопористым фильтром. Сверху гель накрывают тонкой эластичной пластмассовой пленкой, а с боков герметизируют с помощью резиновых прокладок и силиконовой смазки. Затем в течение 1—2 ч гель выдерживают в вакууме, облучая его инфракрасной лампой, находящейся на расстоянии 30 см. [c.200]

Разрезание полиакриламидных гелей [c.201]

После электрофореза поддерживающую среду часто приходит-ся разделять на фрагменты для определения в них ферментативной или антигенной активности, либо радиоактивности. Полоски бумаги или ацетата целлюлозы и пленки высушенного агара можно легко разрезать ножницами или бритвой. Разрезание крахмального геля на продольные блоки относится к обычным процедурам, применяемым при электрофорезе в этом геле. Чтобы выделить разделенные компоненты из крахмального или агарового геля, его чаще всего разрезают бритвой в поперечном направлении. Описан способ фракционирования разбавленного) (0,05—0,1%) агарозного геля путем его расплавления при 80 и последующего сбора капель с помощью коллектора фракций [546]. Что же касается полиакриламидного геля, обладающего [c.201]

ВЫСОКОЙ разрешающей способностью, то для его разрезания требуются специальные устройства, позволяющие разделять гель на мелкие и равные фрагменты. [c.202]

Иногда требуется разрезать гель в продольном направлении, чтобы провести радиоавтографию или одновременное окрашивание электрофореграммы несколькими красителями. В литературе описаны аппараты для продольного разрезания как столбиков (рис. 74). [357], так и пластин [547] полиакриламидного геля. [c.204]

Кроме того, для анализа антигенов применяют принцип простой иммунодиффузии. Лучше всего это сделать, поместив продольно разрезанные цилиндрические столбики геля на поверхность агарового геля, содержащего антитела. Оптимальную концентрацию антител, которую следует внести в гель, определяют в предварительных опытах. Был предложен еще один интересный экспериментальный прием [802]. Полиакриламидный гель формируют в виде полого цилиндра, используя для полимери- [c.244]

При этой процедуре получается в несколько раз больше полос, чем при двойном разрезании, и, следовательно, для обработки данных необходимо сканирование. Этот метод хорош для вставок размером 5—50 т. п. н. Размер вставки может быть оценен по сумме размеров полос (оценка затруднена в случае близкого расположения полос в геле), однако поскольку НтИ не используется для получения банка клонов, то появляются аномальные объединенные фрагменты. [c.44]

В работах [21—24] описаны различные приспособления для разрезания геля, которые отделяют участки заданного размера, причем для получения хорошего разрешения обычно вырезают участки слоя шириной 1—2 мм. Гинджери [25] рассмотрел преимущества и недостатки таких устройств для разрезания геля цилиндрической формы и описал конструкцию и работу усовершенствованного прибора, позволяющего более широко варьировать толщину отрезаемых кусочков геля. [c.139]

При использовании метода сцинтилляционного счета следует обратить внимание на выбор размеров фрагментов, на которые разрезается гель перед измерениями. Очень хорошее разрешение достигается при разрезании геля на узкие полоски, например 0,5 мм, однако при этом возрастает число исследуемых образцов. Время обработки можно сократить, если, по предложению Албаниза и Гудмена [26] получать сначала авторадиограмму, а потом исследовать только зоны, содержащие радиоактивность. [c.153]

Разрезание геля с номон ью набора фиксированных проволочек или бритв (аппараты типа яйцерезки). [c.202]

Зоны нуклеиновых кислот можно обнаружить в геле различными способами. Радиоактивность обычно измеряют путем разрезания геля, солюбилизации в 0,5 М ЫаОН или Н2О2 и использования сцинтилляционного счетчика. Если вещество имеет высокую молекулярную массу, то разрезание геля затруднено, поскольку в таких случаях используют очень мягкий гель для достижения большого размера пор. Двухцепочечную ДНК легче обнаружить при окрашивании флуоресцентным красителем бромидом этидия (рис. 9-11), который имеет повышенный квантовый выход (гл. 15) при связывании с нативной ДНК. Краситель 51а1п8-А11 обладает интересным свойством давать различные окраски с ДНК, РНК и белками. [c.234]

Изоэлектрическое фокусирование в геле имеет определенные преимущества по сравнению с ИФ в среде со стабилизованным градиентом плотности. Эти преимущества состоят в следующем 1) сокращается длительность разделения 2) полностью подавляется термическая конвекция 3) применяется простое оборудование для ИФ 4) возможно одновременное разделение нескольких образцов 5) возможно обнаружение с помощью различных красителей и различных методик 6) возможно объединение ИФ и зонного электрофореза в двухмерном варианте 7) достаточно небольшого количества образца 8) возможно обнаружение белков методом иммунодиффузии. Однако при применении геля возникают проблемы, связанные с молекулярноситовым эффектом, который имеет место в основном при разделении больших молекул. Другой недостаток метода — это низкая точность определения pH в зонах. В настоящее время этот метод (сокращенное обозначение ИФПАА или ПАГИФ) является общепринятым и широко используется. В отдельных случаях, согласно данным [73], при проведении дискретного трубчатого электрофореза в полиакриламидном геле доо пска-ется окрашивание. Для снижения молекулярно-сито<вого эффекта рекомендуется [23] концентрация геля 3,7%. Типичный градиент напряжения для 8-часового разделения составляет 200 В на 60 мм. Если тепло отводится, то напряжение можно увеличить и соответственно сократить длительность разделения. Градиент pH можно измерить после разрезания столбиков с гелем и последующего элюирования сегментов небольшим коли- [c.323]

Гистограммы, полученные при измерении только радиоактивных зон, легче интерпретировать, чем гистограммы, полученные при разрезании всего слоя геля на участки шириной 1—2 мм. Это иллюстрируют рис. 5.4 и 5.5, где приведены электрофоретограммы белков, меченных Ш и С. [c.139]

Гели, Если добавить горячей воды к некоторым веществам, таким, как желатина или- агар, последние легко образуют коллоидные растворы. При охлаждении происходит образование полутвердых систем, называемых гелями. В процессе образования гелей коллоидные частицы адсорбируют на своей поверхности молекулы воды и превращаются в тонкие нити, создающие сетчатую структуру. Вода при этом попадает в пустоты между нитями, в результате чего получается студнеобразная структура. Такую структуру геля легко разрушить разрезанием или сильным встряхиванием, после чего образуется сиропообразный раствор. При вытекании крови из небольшого пореза обра.зуется кровяной сгусток, представляющий собой типичный гель. Через короткий промежуток времени из сгустка начинает выделяться желтоватая жидкость — сыворотка. Это явление называется синерезисом и применяется для отделения сыворотки от кровяных клеток при клиническом анализе крови. В каче- [c.138]

Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу радиоактивного мечения, и кроме того по способу вьщеления исходного набора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят радиоактивным изотопом Р в 5 -конце с использованием [у - Р] АТР и фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплементарные цепи разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь звездочка обозначает радиоактивную метку Р на 5 -конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5 -конце содержат радиоактивную метку, а на другом конце - определенный нуклеотид (см. рис. 9.8). (При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми З -кон-цами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле бок о бок . Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5 -конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду. [c.273]

Рис, 59. Сравнение градиентов pH и результатов изоэлектрического фокусирования белков в 7,5%-НОМ полиакриламидном геле, проведенного в макро- и микромас[нтабах [420]. Гели содержали амфолины фирмы LKB с pH в интервале 3—10. Кривая представляет собой градиент pH, полученный в макрогеле. Светлые кружки обозначают средние значения pH в каждом кусочке разрезанного микрогеля длиной 1 см, отложенные против расстояний от начала геля до середины каждого кусочка. Темные кружки указывают средние расстояния, пройденные стандартными белками при pH, соответствующих изоэлектрическим точкам. Линии, пересекающие темные кружки, отражают утроенную величину среднего стандартного отклоне,ния. Были использованы следующие белки (в порядке увеличения расстояния, пройденного ими от старта) а-ка-зеин, янчный альбумин, бычий сывороточный альбумин, гемоглобин, химотрип-син, а-химотрипсиноген А, рибонуклеаза. [c.153]

Механические повреждения поддерживающей среды, возникающие, например, при разрезании пластин крахмального геля или при извлечении из трубок столбиков полиакриламидного геля, вызывают сильное светорассеяние, проявляющееся в образовании на денситограмме ложных пиков. Столбики геля действуют как цилиндрические линзы. Поэтому их помещают в стеклянные пробирки с уксусной кислотой и сканируют с помощью хорошо сфокусированного и узкого светового луча. Другой способ состоит в том, что гели вставляют в ячейку, изготовленную из двух параллельных стеклянных пластинок, расстояние между которыми несколько меньше, чем диаметр геля. При этом столбики геля слегка сплющиваются и на них образуются плоские поверхности. Световой луч, используемый для сканирования, должен быть немного уже плоскости геля. [c.192]

Тыква и Вотруба [1319] осуществляли сканирование высушенных гелей счетчиком с полупроводниковым детектором [1318]. Важное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет одновременно выявлять несколько радиоактивных нуклидов. При этом все последующие процедуры после разрезания и высушивания геля выполняются автоматически по заранее заданной программе. Описанный метод пригоден для определения и но не позволяет измерять Н. [c.205]

Если полоски крахмального геля отбирают для иммунодиффузии путем сравнения с параллельной окрашенной полоской,, то следует учитывать, что гель сжимается в процессе окрашивания и обецвечивания. Для предотвращения ошибок на этом этапе Паулик [1030] рекомендует перед разрезанием блока геля на пластинки на его смежных сторонах вырезать через рдв-ные интервалы отверстия. При сопоставлении окрашенных и неокрашенных пластинок геля эти отверстия служат указателями для последующего вырезания участков геля, содержащих анализируемые антигены. Паулик провел иммунохимический анализ, выявив таким способом локализацию фракций, разделенных двухмерным электрофорезом в крахмальном геле [1030]. [c.244]

К каждой расщепляемой пробе добавляют по 2 мкл раствора предварительно обработанной прогреванием РНКазы А (BRL) и инкубируют при комнатной температуре 2 мин. Добавляют 5 мкл буфера для нанесения на гель и держат во льду до нанесения иа агарозный гель для анализа. Обычно в качестве маркеров размера используют ДНК фага к, разрезанную Hindlll или E oRl. Мол. массы соответствующих рестрикционных фрагментов приведены в разд. 5.3,3 (примечание в). [c.72]

В действительности интерпретация рис. 21.11 несколько сложнее, но результат тот же самый. Нативный образец (рис. 24.11, ) гетерогенен по т, и наиболее вероятная форма содержит на несколько сверхвитков меньше, чем ее топоизомер с максимальной наблюдаемой сверхспирализацией. Условия в геле в случае, который иллюстрирует рис. 24.11, >1, дают высокое разрешение при достаточно высоких значениях плотности сверхвитков. Это позволяет получить хорошее разрешение для распределения (по топоизомерам) сверхспирализованных молекул в нативном образце, но не в релаксированном. При других условиях в геле наблюдается некоторое распределение сверхспирализованных форм и в полностью релаксированном образце (рис. 24.11, Б). Это не артефакт использования фермента, размыкающего и замыкающего цепи ДНК, поскольку при разрезании одиночных цепей ДНКазой и последующем сшивании их лигазой получается тот же результат. Релаксированный образец должен содержать молекулы с т = О, 1, 2,.. . (рис. 24.12). Так как свободная энергия сверхспирализации равна Вт , то больцмановское распределе- [c.406]

Во всех случаях, когда обработке геяя предшествует его разрезание, следует стремиться к тому, чтббы в одном кусочке геля была вырезана целая полоса или всё белковое пятно. Широко распространенная практика разре ния цилиндрика геля на одинаковые диски толщиной 1—1,5/мм неудачна, так как разрез вслепую может попасть на середину полосы. В результате этого радиоактивность, содержащаяся в полосе, будет просчитана в двойном объеме геля, что д т ложную картину вдвое более широкого и низкого пика ра оактивности на электрофореграмме. [c.112]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология