Электрофокусирование

Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М. Наука, 1983. [c.218]

Для приготовления 2 мл геля, достаточного для заполнения одной трубки при электрофокусировании, смешивают 0,4 мл раствора № 1, [c.100]

Электрофокусирование. В отличие от описанных методов, при которых работают с постоянным pH, здесь электрофорез осуществляется в градиенте pH на основе амфотерных молекул (коммерческие препараты) или уже фиксированных (иммобилизованных), добавляемых в акриламидный гель. В этих условиях белки мигрируют до тех пор, пока не достигнут зоны pH геля, которая соответствует их изоэлектрической точке рН1 (или в этом случае их суммарный заряд равен нулю). Каждая из фракций фокусируется в очень тонкие полосы, что обеспечивает разрешение, обычно недостижимое при других методах. [c.40]

Чтобы закончить с этой методической частью, следует добавить, что существуют и другие обычные, традиционные методы анализа множественных форм ферментов или белков и особенно всевозможные технические приемы хроматографии, иммунохимии или методы, основанные на биохимических свойствах ферментов (кинетика, сродство к субстрату, наличие кофакторов, стабильность при заданных pH или температуре). Однако очевидно, что благодаря весьма неплохой разрешающей способности, возможности одновременно анализировать много образцов (иногда в ничтожно малых количествах) и характеризовать молекулы с одинаковой активностью, электрофорез (и его основные разновидности — в градиенте акриламида и электрофокусирование) остается предпочтительным методом для изучения биохимического полиморфизма в том смысле, как он определяется. [c.41]

При анализе 128-глобулинов подсолнечника и рапса наблюдается явление, сходное с теми, которые выявлены у глобулинов бобовых культур. В среде с малой ионной силой макромолекула обратимо диссоциирует на мономерные формы с константой седиментации 7S (молекулярная масса 150 000 Да). При кислых pH (ниже 3) или щелочных (выше 9) либо в присутствии 6М мочевины происходит диссоциация необратимого характера с образованием соединений (23) S (молекулярная масса 50 000 Да) [100]. Эти мономеры сами состоят из соединенных полипептидных цепей с молекулярной массой от 13 000 до 28 000 Да, с одной стороны, и от 30 ООО до 40 ООО Да — с другой [1, 109] и характеризуются разными р1 (изоэлектрическими точками). У рапса Маккензи [75] путем препаративного электрофокусирования в среде с восстановителем дисульфидных связей и 6М мочевиной изолировал фракции с р1 в пределах 4,5—9. [c.166]

Электрофокусирование представляет собой миграцию молекул амфолита в градиенте pH под действием постоянного напряжения в область со значением pH, равным изоэлектрической точке вещества. Это явление известно довольно давно, однако до последнего времени все попытки применить его для фракционирования белков оставались в значительной мере безуспешными, главным образом из-за трудности создания удовлетворительного градиента pH. Эта задача была решена несколько лет назад благодаря применению синтетических амфолитов-носите-лей. В результате этого электрофокусирование прочно утвердилось как важный метод фракционирования белков. В 1967— 1968 гг. появилось описание метода примерно в 60 работах, что превысило число публикаций, посвященных предшествующим вариантам электрофокусирования, за последние 50 лет. [c.297]

В настоящей главе рассматривается применение электрофокусирования на синтетических амфолитах-носителях, приводятся основные сведения о методе, даются подробные указания относительно фракционирования белков на препаративном уровне при стабилизации градиента pH с помощью градиента плотности, приводится описание аналитического фракционирования в полиакриламидном геле [c.297]

На протяжении всей главы наряду с понятием электрофокусирование будет использоваться термин изоэлектрическое фокусирование . Для этой цели применяли и множество других терминов изоэлектрическое фракционирование, изоэлектрическое конденсирование, стационарный электролиз, непрерывный электролиз, изоэлектрический равновесный электрофорез. [c.298]

Рис. 1. Пояснение принципа электрофокусирования.

Градиент плотности широко применяется для стабилизации среды при электрофокусировании. По завершении опыта такой раствор можно собрать на коллектор для последующего анализа. Поэтому такое разделение может применяться как для аналитических, так и для препаративных целей. [c.302]

Диапазон pH-, pH 3—10 3—6 5—8 7—10 3—5 4—6 5—7 6—8 7—9 8—10. Амфолиты с более узким диапазоном pH можно приготовить самостоятельно из коммерческих амфолитов на обычной колонке для электрофокусирования (см. разд. 8.2.5.3). Амфолиты поставляются в виде 40%-ного водного раствора в фасовке по 25 мл. [c.304]

Для электрофокусирования необходимо иметь источник питания на О—1000 В мощностью 3 Вт, при работе на большой колонке мощность должна быть 6 Вт. Для некоторых случаев вполне достаточно напряжения О—400 В. Кроме того, необходимо иметь миллиамперметр со шкалой до 0,5 мА. [c.304]

Для определения точных значений р1 необходимо тщательно устанавливать температуру при электрофокусировании и измерении pH. Более того, целесообразно осуществлять фокусирование при пониженной температуре, поскольку при длительном эксперименте возникает опасность микробного заражения колонки. Поэтому комплект для электрофокусирования должен включать аппаратуру для охлаждения, контроля за температурой и подачи хладоагента. [c.305]

По окончании электрофокусирования содержимое колонки сливают обычным способом. Однако для наполнения колонки и слива предпочитают использовать многоканальный перистальтический насос. [c.305]

ТСГФ удобно использовать в качестве экономного пробного метода для выбора типа геля и скорости элюции при подготовке препаративной очистки белка гель-фильтрацией на колонке. Малое количество необходимого препарата и возможность одновременного обследования нескольких препаратов делает метод ТСГФ привлекательным и для клиники, где он может дополнить, а иногда и заменить электрофорез и электрофокусирование. [c.165]

После окончания электрофокусирования гели извлекают из трубок. Часть гелей прокрашивают для выявления белковых зон, а один или два геля используют для измерения градиента pH, сформированного в ходе изоэлектрофокусирования. Существует много вариантов окраски гелей. Один из них состоит в том, что гели погружают на 1 ч в 0,075%-ный раствор кумасси (7-250 в 3,5%-ном растворе НСЮ4. Затем гели 3— [c.101]

Остерман Л, А. Введение радиоактивной метки в белки//Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэдектрофорезом и радио-иэотопными методами/Под ред. Г. П. Георгиева. М., 1983. С. 236. [c.327]

Рис. 5. Схема, по<спиощая метод электрофокусирования а образование градиента концентрации лигацда [А] б - распределение ионных форм мигранта в - концентрирование лиганда в узкой зоне - концетрация мигранта.

Изоэлектрическое фокусирование [42 — 45] в линейном градиенте pH позволяет разделить белки, характеризующиеся различными изоэлектрическими точками. Для создания градиента используют носители с цвнттер-ионными свойствами — алифатические полиаминополикарбоновые кислоты, имеющие М 200 — 700. При движении в градиенте pH суммарный заряд белка постоянно меняется, и в области pH, близких к изоэлектрической точке, становится равным нулю. Соответствующий белок фокусируется , образуя узкую зону. При препаративном фокусировании в колонке стабилизация градиента pH осуществляется с помощью градиента плотности используемого буферного раствора, однако чаще работают с плоскими слоями полиакриламидного или гранулированного геля. Опубликовано краткое сообщение о непрерьтном электрофокусировании без носителя [46]. Эффективность электрофокусирования высока. Так, возможно, например, разделить белки, различающиеся по ИЭТ лишь на 0,01 единицы pH. При разделении сыворотки образуется более 40 белковых полос. [c.351]

Для контроля за степенью очистки белков чаще применяют метод электрофореза. Большинство авторов в качестве носителя используют гомогенные гели или градиент концентрации акриламида. Основной способ при этом — электрофорез в диссоциирующей среде ДДС-Na соответственно процедуре, которую описал Лэммли [68]. В определенных случаях завершающим приемом при этом являются иммунодиффузия [29, 114] либо иммуноэлектрофорез [17, 80, 118]. При исследовании структуры некоторые авторы прибегают к двумерному электрофорезу. Тогда первая миграция молекул может происходить в гомогенном геле полиакриламида с ДДС-Na или без него во втором направлении молекулы мигрируют в полиакриламидном геле с ДДС-Na в присутствии восстановителей дисульфидных связей (р-меркапто-этанол) [10, 40, 61, 78]. Чтобы охарактеризовать субъединицы легуминов гороха и конских бобов, Матта и др. [77, 78] применяют сочетание ДДС-Na с р-меркаптоэнталом и электрофокусированием. Рестани и др. [92 пользуются этим же способом применительно к глобулинам люпина, а Ху и Еэзен [53] демонстрировали гетерогенность белков сои. Указанные методы с [c.155]

Между тем все выделенные фракции невосстановленных белков имеют сложный состав. Фракционирование единиц глютенинов после восстановления дисульфидных связей алкилирования позволяет отделить более простые фракции. Для этого в основном применяют методы электрофореза ДДС-Na-nAAF, электрофокусирование, ДДС-Na-nAAr совместно с электрофокусировкой [20, 92, 108], но с определенным успехом использовали также гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию. [c.200]

Аминокислота Выделенные с помощью ДДС-Ыа-ПААГ 57] Выделенные гель-фильтра-цией и изоэлек-трофокусирова-ние.м Выделенные гель-фильтрацией. ионообмен ной хроматографией и изо электрофокусированием Субъединица агрегированного глиадина 11671 [c.207]

Анализ субъединиц глютенина с помощью электрофореза при кислых pH или двумерного электрофореза ДДС-ПААГ-ИЭФ или ДДС-ПААГ в формирующемся градиенте pH обнаруживает значительные различия их зарядов. Каждую полосу, наблюдаемую при одномерном электрофорезе и соответствующую определенной молекулярной массе, можно посредством электрофокусирования разделить на большое число белков, отличающихся своими изоэлектрическими точками. Так, по Данно и др. [57], субъединицы с предполагаемой молекулярной массой в пределах [c.208]

Да имеют изоэлектрические точки р1 от 6 до 8 у субъединиц с молекулярной массой свыше 95 000 Да—р1 в пределах 6—7. Одной полосе, выявленной одномерным электрофорезом, могут соответствовать более 12 по-разному заряженных компонентов. Кан и Бушук [111] электрофокусированием субъединиц с молекулярной массой от 68 000 до 134 Да между pH 6 и 8 идентифицировали не менее 20 различных белков. Хольт и др. [92] уточнили гетерогенность зарядов и генетическое происхождение высокомолекулярных субъединиц. Они в большей мере связывали эту гетерогенность с соотношениями глутаминовой кислоты и глутамина в субъединицах, чем с постоянно низким содержанием основных аминокислот, причем баланс во всех случаях явно складывается в пользу глутамина. [c.208]

В приборе для электрофокусирования в градиенте плотности должен быть предусмотрен отвод образующихся газов из электродного пространства без нарушения градиента. Наиболее простым прибором такого типа является О-образная трубка. Одно плечо трубки заполнено раствором с градиентом плотности, здесь же в растворе помещается один из электродов, второй электрод находится в другом плече с раствором, уравновешивающим содержимое основного плеча. Более сложный прибор Вестерберга и Свенссона [24] состоит из двух концентрически расположенных отделений вспомогательного — внутреннего и рабочего — наружного. Поскольку для электрофокусирования в градиенте [c.302]

Рис. 2. Схема колонки конструкции Вестерберга и Свенссона для электрофокусирования в градиенте плотности.

В этом разделе приводится методика электрофокусирования в градиенте сахарозы в широком диапазоне pH на колонке Вестерберга и Свенссона объемом ПО мл. Полученные таким путем сведения относительно изоточки исследуемого вещества служат обычно исходными данными для постановки более тонкого эксперимента в более пологом градиенте pH и при более высокой напряженности электрического поля. В случае необходимости приведенные здесь условия можно варьировать с учетом рекомендаций, упомянутых в разд. 8.2.5. Полное описание экспериментов по электрофокусированию дано в работе [24]. [c.306]

Вестерберг и Свеиссон [24] сравнивали поведение компонентов миоглобина во время электрофокусирования при 4 и 25°С. Они обнаружили, что pH сфокусированной зоны не зависит от температуры эксперимента и определяется лишь температурой, при которой производили измерение. Следовательно, для определения изоточки при данной температуре можно измерить pH в соответствующих условиях независимо от температуры фокусирования. Обычно р1 уменьшается при увеличении температуры. [c.308]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология