Иммунофлуоресцентные антитела

Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью поликлональной антисыворотки представляет собой удобный и точный метод подсчета зараженных клеток и выявления места размножения вируса при анализе фиксированных срезов зараженных тканей. Используя моноклональные антитела против индивидуальных вирусных полипептидов, иммунофлуоресцентным методом можно изучать и внутриклеточную локализацию вирусных антигенов. [c.139]

Иммунофлуоресцентная окраска кольцеобразно охватывает В-клетку рис. 2.12). Бивалентные антитела к иммуноглобулину, взаимодействуя с рецепторами, вызывают их перекрестное связывание с образованием иммуноглобулиновых пятен неправильной формы на клеточной поверхности. При повышении температуры большинство этих пятен активно перемещается по поверхности клетки и собирается на одном из ее полюсов в виде колпачка рис. 2.12 врезка). За этим процессом, названным кэппингом, следует погружение (интернализация) молекул иммуноглобулина внутрь клетки, где они подвергаются расщеплению. Кэппинг можно также наблюдать с другими поверхностными гликопротеинами и не только на В-клетках. [c.26]

Животное многократно иммунизируют, пока содержание антител (главным образом IgG) в сыворотке не достигнет определимого уровня. Последующее подкожное или внутрикожное введение антигена приводит к развитию местной реакции, иногда с выраженным отеком и кровоизлияниями (в зависимости от количества введенного антигена). Реакция достигает пика через 4-10 ч, а затем затухает, и через 48 ч обычно остаются лишь минимальные ее проявления рис. 25.9). Иммунофлуоресцентные исследования показывают, что вслед за отложением антигена, антител и комплемента в стенках сосудов происходит их нейтрофильная инфильтрация, а внутри сосудов скапливаются тромбоциты рис. 25.10). Все это может приводить к окклюзии сосудов и в тяжелых случаях к некрозу ткани. Через 24—48 ч нейтрофилы замещаются мононуклеарными клетка- [c.459]

На графике показана зависимость появления различных признаков аутоиммунного заболевания от возраста у самок мышей NZB/NZ N. По оси ординат отложена частота - доля мышей данного возраста, у которых выявляются указанные признаки. Иммунные комплексы определяли с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания почечных срезов, антиядерные антитела в сыворотке - методом непрямой иммунофлуоресценции. Показателем поражения почек служила протеинурия. Аутоантитела к эритроцитам при данном заболевании появляются позднее и поэтому, вероятно, менее связаны с возникновением почечной патологии. У мышей-самцов заболевание возникает примерно на 3 мес позднее. [c.460]

Иммунофлуоресцентные методы широко используются для обнаружения аутоантител и антител к тканевым и клеточным антигенам (рис. 29.8). Хотя эти методы технически более сложны, чем описанные выше, они имеют явное преимущество в тех случаях, когда требуется определить число видов антител. Используя срезы тканей (содержащих большое число антигенов), на одном предметном стекле можно выявить антитела к нескольким разным антигенам, установив при этом их внутритканевое (клеточное) или внутриклеточное распределение. [c.530]

Кроме того, с помощью иммунофлуоресцентных тестов можно идентифицировать отдельные клетки в клеточной суспензии, т. е. выявлять антигены на поверхности живых клеток. Для этой цели суспензию живых клеток, флуоресцентно окрашенных специфичными реагентами, пропускают через проточный флуоресцентный клеточный сортер - прибор, измеряющий интенсивность свечения каждой клетки в разных областях спектра и затем разделяющий клетки по параметрам свечения. Данный метод позволяет выделять различные клеточные популяции, т. е. разделять клетки, несущие специфические поверхностные антигены и соответственно этому окрашенные различными флуоресцентно меченными антителами (рис. 29.9). В гл. 13 приведены данные о том, как используется этот метод для определения субпопуляций развивающихся тимоцитов (см. рис. 13.19). [c.530]

Прямой иммунофлуоресцентный метод. Раствор антител, меченных флуоресцентным красителем, наносят на поверхность среза препарат инкубируют, после чего отмывают от избытка антител. Затем связавшиеся антитела выявляют при помощи флуоресцентного микроскопа. Пучок УФ-лучей, направленный на срез через объектив, позволяет видеть темное поле со светящимися зеленым цветом участками, где локализованы связанные антитела. Распределение флуоресценции на срезе имеет характерный вид для каждого тканевого антигена. [c.533]

Непрямой иммунофлуоресцентный метод со связыванием комплемента. Этот вариант метода разработан для определения комплемент-связываю-щих антител (см. рис. 29.7). После обработки среза антителами на него наносят в качестве источника комплемента свежую сыворотку. Комплемент связывается в участках, где фиксированы антитела. В результате эффекта усиления при активации комплемента по классическому пути (см. гл. 5) одна молекула антител может вызвать связывание многих СЗЬ-молекул на срезе их выявляют, обрабатывая срез флуоресцентно меченными антителами анти-СЗЬ. [c.533]

С использованием специально полученных новых моноклональных антител и иммунофлуоресцентного метода вы идентифицировали некую молекулу на поверхности Т-лимфоцитов. Выберите методы, позволяющие получить ответы на следующие вопросы [c.546]

Вы выясняете локализацию модифицированных С-белков в клетке с помощью метода иммунофлуоресцентной микроскопии, используя специфичные к С-белкам антитела с флуоресцентными маркерами. [c.120]

В целях определения D-антигенов используют 3 главных метода с моноклональными антителами иммунофлуоресцентный, иммуноосадочный (иммунопреципитация) и иммуногистологический на тканевых срезах. К началу 90-х годов было определено 78 D-антигенов ( D1— D78), часть из которых представлена в таблице 59. [c.567]

При наличии гибридов производят смену среды Дальбекко (без аминоптерина) в течение последующих 14 дней и, наконец, добавляют минимальную модифицированную среду Дальбекко. После этого следует скрининг (от англ. s reen — решето, хфосеивать) гибридных клеток по образованию антител, используя серологические реакции, радиоиммунный, иммунофлуоресцентный или иммуноферментный анализ. Более чувствительный из них радиоиммунный метод. [c.576]

Рис. 6-37. Три домена плазматической мембраны сперматозоида морской свинки, выявляемые с помощью моноклональных антител. Сперматозоид показан схематически в верхней части рисунка. На каждой из трех микрофотографий (А, Б и В) иммунофлуоресцентное окращивание клеточной поверхности различными моноклональными антителами сочетается с фазово-контрастным изображением тех же клеток. Антитела на (AJ метят только верхнюю часть головки, на (Б) - только нижнюю часть головки, а на (В) - только хвост. (АнБ предоставлены D. G. Myles et al.. ell, 23, 434-

Мембранные домены могут поддерживаться клеткой и без межклеточных контактов. К примеру, сперматозоид животных - это отдельная клетка, состоящая из двух структурно и функционально различных частей - головки и хвоста, покрытых непрерывной плазматической мембраной. Нри исследовании клеток спермы методом иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием различных антител к антигенам поверхности клетки обнаружили, что плазматическая мембрана состоит по крайней мере из трех различных доменов (рис. 6-37). В некоторых случаях антигены могут диффундировать внутри собственных обособленных доменов. Однако остается непонятным механизм того, каким образом поддерживается обособлеппость этих доменов. [c.376]

Рис. 7-3. А. Световая микрофотография цепочек вытянутых митохондрий в живой клетке в культуре ткани млекопитающего. Клетка обработана витальным флуоресцентным красителем (родамином 123), специфически окрашивающим митохондрии. Б. Иммунофлуоресцентная микрофотография той же самой клетки, обработанной (после фиксации) флуоресцентными антителами к микротрубочкам. Обратите внимание, что митохондрии располагаются в основном вдоль микротрубочек. Масштабный отрезок 10 мкм. (С любезного разрешения Lan Во hen )

Рис 10-10. Иммунофлуоресцентная микрофотография фибробластов кожи куриного эмбриона, превратившихся в клетки мышц при экспрессии в них гена myoDl, которая была вызвана искусственным путем Эти фибробласты выращивали в культуре и за три дня до съемки трансформировали рекомбинантной плазмидной ДНК В состав этой плазмиды входили последовательности, кодирующие белок myoD, которые соединены с промотором/энхансером вирусного происхождения, активным в куриных эмбрионах. Несколько процентов фибробластов включало ДНК и продуцировало белок myoD Эти клетки слились с образованием удлиненных миофибрилл, которые на этой фотографии помечены антителами, выявляющими белок, специфичный для мышц В контрольной культуре, трансфицированной другой плазмидой, мышечные клетки [c.182]

Рис. 11-73. Иммунофлуоресцентная микрофотография эпителиальных клеток кенгуровой крысы (PtK2) в интерфазе. Клетки окрашены одновременно антителами к виментину (Aj и к кератину (Б). Обратите внимание, что содержащиеся в клетке системы виментиновых и кератиновых

Особый интерес представляет флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), образующий связь с белками антител без нарушения их способности соединяться с гомологичными антигенами. Меченные ФИТЦ антитела представляют собой высокочувствительные индикаторы на соответствующие антигены. Антитела получают общепринятыми методами из крови иммунизированных кроликов и затем флуорохромируют. Кроме того, широко используются готовые, меченные флуорохромом определенные антисьшоротки, а также готовый комплекс ФИТЦ-у-глобулин. Иммунофлуоресцентный анализ широко применяется в медицинской и санитарной микробиологии, генетике, систематике, экологии микроорганизмов. [c.112]

Иммунофлуоресцентное окрашивание непрямой метод. Включает два этапа. Препарат фиксируют нагреванием, наносят каплю нелюминесцирующей гомологичной иммунной сыворотки определенного разведения и оставляют на 20—30 мин во влажной камере. Затем осторожно промывают в течение 5 мин. На втором этапе на препарат наносят каплю меченого антикроличьего 7-глобулина, разведенного до так называемого окрашивающего титра. Время инкубации на втором этапе и окрашивающий титр определяют эспериментально. После этого препарат осторожно промывают и микроскопируют при увеличении 90X. Непрямой метод обладает принципиальным преимуществом, так как, имея лишь одну люминесцирующую сыворотку, можно отыскать большое число разных антигенов, используя стандартные кроличьи сыворотки. При непрямом методе, однако, крайне важен контроль, включающий инкубирование препарата на втором этапе непосредственно с меченой сывороткой обработку препарата гетеро-логичной меченой сывороткой обработку препарата на первом этапе нормальной или гетерологичной сывороткой, не содержащей антител к исследуемому антигену. [c.113]

Линия опухолевых клеток легкого человека 2563 (полученная из опухоли МАС-21) была использована Акесоном [37] непосредственно в качестве антигена для кроликов. При анализе полученной антисыворотки с помощью реакции связывания комплемента, иммунофлуоресцентного теста и метода насыщающего связывания в ней обнаружили антитела, специфические для антигенов нормальной ткаии почек. Эти антитела могли быть избирательно адсорбированы препаратами легочной ткани следовательно, существует антиген, общий для этих двух нормальных органов. [c.152]

Сериани с сотрудниками предоставили данные, показывающие наличие специфических антигенов молочной железы в нормальных и опухолевых клетках молочной железы. Эти исследователи иммунизировали кроликов обезжиренным препаратом верхней фракции отстоенного молока человека. Видоспецифические антитела удалялись из этой сыворотки путем адсорбции на эритроциты человека. Результаты непрямого иммунофлуоресцентного анализа показали, что антитела, содержащиеся в такой антисыворотке, специфически связываются с линиями клеток нормальной молочной железы и карциномы молочной железы человека. Был предложен чувствительный метод радиоиммуноанализа, позволивший получить количественное подтверждение этих результатов. Семь линий карциномы молочной железы и первичные культуры эпителия молочной железы связывали по крайней мере в 10—30 раз больше антител, чем фибробласты молочной железы и эпителиальные клетки из других источников. Трипсинизация клеток МСР-7 и МДА-МВ-157 приводила к снижению реактивности клеток на 80—84%, что указывало на поверхностную локализацию антигенов, специфических для молочной железы [38]. [c.152]

Работа с антителами зачастую требует от исследователя самостоятельного получения реагентов, в связи с чем в первую очередь возникает задача получения иммуногена. В случае растворимых простых иммуногенов для достижения хороших результатов молекулы должны быть как можно лучше очищены. Поэтому первый рассматриваемый метод — это оценка чистоты антигенного препарата. После сбора антисыворотки необходимо оценить ее качество. В зависимости от характера тест-системы, используемой на заключительном этапе, сыворотку необходимо проверить на специфичность, титр и параметры связывания. Это требует знания процедур контроля качества, в некоторых случаях включающих в себя определение изотопического спектра антител. На заключительном этапе важен правильный выбор теста (табл. 1.2)—.например, выбор между иммунофлуоресцентным и иммунопероксидазным методами в случае тканевых и клеточных антигенов либо между агглютинацией, ELISA, РИА и реакциями преципитации в случае растворимых антигенов. При использовании некоторых тест-систем может потребоваться очистка антител для последующего мечения либо получение и мечение антиглобулинового реагента. К оценке преимуществ и недостатков тест-систем следует подходить осторожно. [c.30]

Последняя проблема, которую необходимо решить, — это проблема скрининга. Важно иметь надежную методику для простого и точного скрининга культуральных жидкостей отдельных клонов на содержание антител нужной специфичности. Избранный метод (например, РИА, ELISA и т. д.) должен быть чувствительным и должен давать по возможности количественную информацию. Анализ, основанный на связывании флуоресцент-номеченных антител (иммунофлуоресцентный метод, ИФМ), требует наличия 0,2—1 мкг МА в 25 мкл культуральной жидкости. При этом с его помощью можно определять большинство типов детерминант клеточных поверхностей. Этот метод дает также количественную информацию о среднем числе молекул, экспрессируемых на одной клетке, что является немаловажным преимуществом в случае низкоаффинных МА. Поскольку [c.178]

Рис. 4. Непрямой иммунофлуоресцентный метод гаптенизированных антител. Два препарата аллоиммунных антител конъюгированы с двумя гаптенами, не имеющими между собой антигенного перекреста (изображены черными кружками н прямоугольникамв). Их используют вместе с двумя препаратами соответствующих антнгаптеновых антител, меченных флуоресцеином (Ф) или родамином (Р). Это по.зволяет окрасить на поверхности клетки одновре-мелно два аллоантигена (изображены белыми прямоугольниками или треугольниками).

Иммунофлуоресцентное окрашивание применяется также для быстрой диагностики вирусных инфекций. Это направление недавно рассмотрено в исчерпывающих обзорах [12, 13], а конкретные методы обнаружения РСВ в клиническом материале описаны в работе Гарднера и др. [14]. Икмунофлуоресценция — более точный метод выявления РСВ в организме больного, чем непосредственное выделение вируса, поскольку в период рекон-валесценции после вызванного РСВ заболевания зараженные клетки бывают покрыты противовирусными антителами. [c.139]

Биологические технологии позюлили совершить прорыв в сферу иммунной диагностики. Современная иммунная диагностика (например, иммунофлуоресцентный анализ и др.) характеризуется простотой, высокой специфичностью и универсальностью. Отдельные диагностикумы позволяют прогнозировать развитие патологий задолго до субъективных проявлений. Моноклональные антитела, полученные путем генной инженерии, позволяют диагностировать беременность, выявлять предрасположенность к диабету, раку, ревматоидному артриту, идентифицировать наследственные заболевания (сопроюждаюпщеся потерей определенных ферментов или других белковых компонентов). [c.181]

Следует подчеркнуть, что маркеры, экспрессируемые лимфоцитами, можно обнаружить и на клетках иных линий. Так, С044 часто выявляется на клетках эпителия. Молекулы клеточной поверхности можно выявить с помощью флуоресцирующих антител, используемых в качестве зондов (рис. 2.9). На этом подходе основан метод проточной иммунофлуоресцентной цитометрии, позволяющей сортировать и подсчитывать клетки в зависимости от их размеров и параметров флуоресценции (см. гл. 29). С помощью этого метода удается проводить детальную сортировку популяций лимфоидных клеток. [c.23]

Непрямой иммунофлуоресцентный метод. Раствор немеченных антител наносят на срез, а затем выявляют их при помощи меченных флуорохромом антииммуноглобулиновых антител. [c.533]

Рассмотренные системы НПВОФ базируются на детектировании флуоресцентного сигнала под прямым углом. Можно использовать и детектирование по ходу отраженного пучка (рис. 33.1,г). Для детектирования сигнала в этом режиме в работах [8, 46] использовали как кварцевые пластинки, так и кварцевые оптические волокна. Для иммунофлуоресцентного анализа по двухцентровой реакции предел обнаружения IgG после десятиминутной инкубации с FIT -антителами достигает 3,0 и 1,5 мкг/мл для плоских и волоконных волноводов соответственно. [c.533]

Рис. 9-89. Иммунофлуоресцентное мечение ядра фибробласта человека моноклональными антителами к мяРНП-частицам, участвующим в сплайсинге молекул-предшественников мРНК. Частицы мяРНП образуют большие агрегаты, которые могут функционировать как островки сплайсинга . Антитела выявляют определенные белки, присутствующие в ряде мяРНК и участвующие в работе сплайсосомы. (С любезного

Справочник химика 21

Химия и химическая технология