Комплемент методы определения

I. Определение индивидуальных антигенов в растворе (РИД). Данный -метод обычно используют для определения сывороточных белков, в частности иммуноглобулинов при подозрении на множественную миелому или в случае недостаточности иммуноглобулинов. Можно определять и компоненты комплемента. В основном с помощью РИД определяют любые антигены (при наличии специфических антител), концентрация которых составляет не менее 5 мкг/мл и мол. масса не превышает 10 . Необходим и стандартный препарат антигена. Стан- [c.208]

Метод фиксации комплемента обычно в 50—100 раз более чувствителен, чем реакция преципитации. Он дает возможность в ряде случаев определять до 0,01 мкг некоторых антигенов. Главным его недостатком является то, что в некоторых смесях, используемых для анализа с целью определения антигена, могут присутствовать вещества, инактивирующие комплемент (анти-комплементарные вещества) или стимулирующие протекание гемолиза. [c.256]

Гемолитический метод в силу своей доступности и возможности точного определения уровня комплемента получил широкое применение при его титровании. Степень гемолиза при постановке опыта может быть определена с помощью фотоколориметра, спектрофотометра или визуально посредством сопоставления гемолиза в опытных пробирках со стандартной шкалой лизированных эритроцитов. Последний способ наиболее прост, не требует для постановки реакции дефицит- [c.150]

Иммунный комплекс. Продукт реакции антиген-антитело, который может также содержать в своем составе компоненты системы комплемента. Иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг). Метод идентификации белков и определения их свойств с использованием антител. [c.558]

Непрямой иммунофлуоресцентный метод со связыванием комплемента. Этот вариант метода разработан для определения комплемент-связываю-щих антител (см. рис. 29.7). После обработки среза антителами на него наносят в качестве источника комплемента свежую сыворотку. Комплемент связывается в участках, где фиксированы антитела. В результате эффекта усиления при активации комплемента по классическому пути (см. гл. 5) одна молекула антител может вызвать связывание многих СЗЬ-молекул на срезе их выявляют, обрабатывая срез флуоресцентно меченными антителами анти-СЗЬ. [c.533]

Для постановки реакции определения титра комплемента гемолитическим методом с визуальным определением степени гемолиза требуются , 1) сыворотка крови, подлежащая исследованию, взятая в день постановки опыта или полученная заранее и законсервированная 2) изотонический раствор [c.151]

При этих методах используются две системы антиген — антитело с одной стороны, подлежащая изучению система антиген — антитело и, с другой — система красных кровяных телец барана и антиэритроцитарных антител барана. Метод состоит из двух этапов увеличивающееся количество антигена добавляют к одному и тому же количеству антисыворотки против этого антигена (ее предварительно освобождают от комплемента нагреванием до 56 °С), к которому прибавляют определенное количество комплемента морской свинки. Контролем является только иммунная сыворотка, антигены испытывают параллельно. В ходе этой реакции (24 ч при 4 °С) какая-то часть комплемента морской свинки свяжется с иммунными комплексами по мере завершения в каждом образце реакции антиген — антитело. Несвязанную часть комплемента количественно определяют на втором этапе [c.103]

В 60-х годах были достигнуты важные успехи, открывшие новые пути изучения В-клеток. Первым из ннх была разработка метода локального гемолиза, который позволил идентифицировать и подсчитывать индивидуальные В-клетки, вырабатывающие антитела к определенному антигену. В простейшем варианте этого метода берут лимфоциты (обычно из селезенки) у животного, иммунизированного бараньими эритроцитами (БЭ). Их помещают затем в агар вместе с избытком Ю. В результате на чашке получается газон из иммобилизованных БЭ с вкраплением лимфоцитов. В этих условиях клетки не могут передвигаться, но любые выделяемые В-клеткой антитела будут диффундировать и покрывать поверхность всех БЭ, находящихся поблизости. Такие покрытые антителами эритроциты можно лизировать, добавив комплемент (разд. 17.5). Таким образом, присутствие каждой выделяющей антитела клетки обнаруживается по прозрачному пятну ( бляшке ) в темном слое БЭ. Аналогичный метод можно использовать для подсчета клеток, вырабатывающих антитела к другим антигенам, таким как белки или полисахариды, если присоединить эти антигены к поверхности бараньих эритроцитов. [c.20]

Реакция антиген—антитело ведет к образованию иммунных комплексов, которые связывают комплемент при его активации по классическому пути, и на этом основан один из количественных методов определения антигенов и антител (рис. 29.7). С помошью реакций гемагглютинации и связывания комплемента удается выявлять антитела, присутствующие в концентрации <1 мкг/мл. [c.530]

Долгое время комплемент рассматривался как в высшей степени сомнительное образование многие специалисты в области иммунобиологии вообще отказывались считать его каким-то особым веществом и в крайнем случае соглашались признать, что речь идет об особом состоянии некоторых веществ. Лишь недавно стало достоверно известно, что комплемент действительно представляет собой определенное вещество, хотя присутствует обычно в очень малых количествах. Поэтому при помощи прежних методов исследования его просто пе удавалось выявить. В настоящее время известно несколько фракций комплемента. Мало того, с помощью электронного микроскопа действие комплемента удалось увидеть. В оболочках эритроцитов после обработки комплементом можно увидеть маленькие дырочки это выглядит так, словно клетки буквально прострелены комплементом. Через них содержимое постепенно вытекает, пока клетка не растворится полностью. [c.365]

Уже давно было найдено, что комплемент соединяется с комплексом антиген — антитело. Благодаря происходящему при этом гемолизу можно идентифицировать ничтожные количества комплемента. Эта проба является самым чувствительным методом из всех используемых для обнаружения соединения антигена с антителом. Эритроциты, подвергающиеся действию соответствующего агглютинина, соединяются сперва с С 1, С 2 и С 4, а затем уже с С З [127]. Количественное определение каждого из этих четырех компонентов представляет большие трудности вследствие того, что любой из них обнаруживается лишь в присутствии трех других компонентов, а также потому, что их концентрация в сыворотке очень низка. [c.348]

Определение титра комплемента гемолитическим методом. [c.150]

Для доказательства того, что антиген не стимулирует пролиферации В-клеток, необходимо включить следующие контроли а) предварительную обработку клеток лимфатических узлов сывороткой анти-Thy-1.2 с комплементом (в этом случае следует ожидать, что включение тимидина не превысит фонового уровня) б) определение в культуре антиген-специфических антителообразующих клеток методом локального гемолиза (следует ожидать незначительного фонового уровня) в) окрашивание стимулированных клеток конъюгированной с флуоресцеином сывороткой к мышиному Ig (пролиферирующие клетки должны быть Ig-). [c.324]

Участие комплемента в гемолизе эритроцитов можйо использовать для определения концентрации антител (или антигенов) методом так называемой реакции связывания комплемента . В этом случае нет нужды в посадке рабочего антигена на поверхность эритроцитов. Их используют в комплексе со своими, специфическими антителами, полученными из сыворотки друго- [c.121]

Для определения антителообразующих клеток методом локального гемолиза, или бляшкообразования. к исследуемой клеточной популяции добавляют эритроциты, сенсибилизированные антигеном. При последующей инкубации эритроциты, окружающие антителообразующую клетку, связывают секретируемые ею специфические антитела и в результате лизируются комплементом. Вид образующейся при зтом зоны просветления - бляшки - с В-клеткой в центре показан справа. Локальный гемолиз может быть двух типов. [c.542]

Сыворотка крови содержит целый класс белков, не являющихся иммуноглобулинами и носящих название комплемента или К. Комплемент не реагирует с антигеном или антителом по отдельности, однако взаимодействует с разнообразными комплексами антиген — антитело. По неясным пока причинам комплемент не реагирует с комплексами гаптен — антитело. Поэтому для определения гаптенов обычно используют метод торможения (см. следующий раздел). [c.253]

Для выявления какого-либо поверхностного клеточного антигена нужно иметь специфичные к нему антитела и метод, позволяющий подсчитать, какое число клеток в данной популяции связывает эти антитела. Приготовление антисывороток к поверхностным клеточным антигенам подробно описано в гл. 13. Существуют два основных способа выявления клеток, несущих такие антигены. Один из них состоит в том, что антисыворотку обрабатывают флуорохромом, и в результате этого соответствующие клетки флуоресцируют в ультрафиолете (см. гл. 9). Вместо этого можно обрабатывать клеточную популяцию антисывороткой и комплементом при этом клетки, связавшие антитела, погибают, и их можно обнаружить с помощью витального красителя, например трипанового синего. В настоящей главе описан метод определения поверхностных клеточных антигенов, в котором клетки, связавшие антитела, выявляются с помощью особым образом обработанных бараньих эритроцитов (БЭ). Преимущество этого метода состоит в том, что, обладая высокой чувствительностью, он позволяет достаточно быстро исследовать большое число клеток антитела при этом используются в немодифи- [c.273]

ИФМ имеет ряд существенных преимуществ перед цитоток-сическими тестами, ELISA и РИА. Во-первых, с помощью ИФМ можно определять молекулы, присутствующие на клеточных поверхностях с плотностью до нескольких тысяч копий на клетку. Во многих случаях, когда методы ELISA на клеточных поверхностях, цитотоксические тесты или РИА оказываются недостаточно чувствительными, антигены плазматической мембраны удается определить с помощью ИФМ. Во-вторых, при исследовании ИФМ имеется возможность достаточно просто детектировать антитела практически всех классов иммуноглобулинов. Например, в настоящее время имеется несколько видов мышиных МА против каппа-легких цепей иммуноглобулинов крыс. Поскольку от 90 до 95% всех иммуноглобулинов крыс содержат каппа-легкую цепь, эти МА существенно улучшают возможности скрининга. В отличие от этого в цитотоксических тестах желательно, чтобы МА принадлежали к классу IgM, так как при этом фиксация комплемента обеспечивается с наибольшей эффективностью. В-третьих, при проведении ИФМ на проточном флуорометрическом клеточном сортере (ПФКС) для каждого определения связывания антител анализируется большое число клеток. Если для каждого образца имеется возможность просчитывать 5—10-10 клеток, то значительно уменьшается вероятность ошибок. [c.179]

Кривая, представляюш,ая часть комплемента, связанную в первой реакции (разные количества антигена на то же количество антител и комплемента морской свинки), имеет форму колокола, максимум ее соответствует определенному соотношению антигена и антитела, называемому эквивалентностью. Указанный метод особенно чувствителен для выявления структурных различий белков [13, 92, 93 пример этого приведен на рисунке 4.7. Для данного метода необходимо, чтобы антисыворотка была моноспецифична, когда исследуются биологические растворы или экстракты, содержащие смесь белков. [c.104]

Ферментативное расщепление ИгГ имеет особое значение при исследовании различных биологических свойств молекулы. Продолжая работы, начатые по исследованию действия нескольких протеолитических ферментов, ряд авторов показали, что папаин расщепляет ИгГ кролика на три крупных фрагмента — I, ПиШ — с образованием очень малого количества мелких пептидов. Фрагменты I и II имеют молекулярный вес около 42 ООО, III — несколько больше. Как I, так и II содержат участки со свойствами антител, обладающие сродством к специфическому антигену, что было показано несколькими методами [1, 20, 21, 22]. Фрагмент III легко кристаллизуется и содержит в основном изотипические (т. е. видоспецифические) антигенные участки. Аллотипические антигенные участки (т. е. участки, определяющие отличия между иммуноглобулинами разных индивидуумов одного и того же вида) связаны с фрагментами I и II, тогда как способность фиксироваться на KOHie и проходить через плаценту, но-видимому, связана со структурными особенностями фрагмента III. Связывание комплемента после реакции ИгГ со специфическим антигеном представляет собой сложную реакцию, в которой принимают участие все части молекулы, входящие во фрагменты I, II и III [23]. Вполне возможно, что наиболее важным моментом для выяснения структуры молекулы является тот факт, что все указанные биологические свойства сохраняются после расщепления молекулы на три части. Это дает веские основания для предположения, что папаин гидролизует пептидные связи на небольшом уязвимом участке и что исходная молекула состоит из определенных частей, пространственная структура которых не затрагивается при гидролизе. Нисонов и сотр. [24] показали, что при гидролизе пепсином образуется одна фракция с молекулярным весом около 100 ООО, в которой сохраняются оба участка антитела. При восстановлении цистепном в низкой концентрации эта фракция расщепляется на равные части, которые по биологическим и химическим свойствам очень сходны с фрагментами [c.104]

В агар добавляют также большой избыток тех же эритроцитов. Агар разливают тонким слоем в чашки Петри и инкубируют последние 1 ч при 37° С. За этот срок ан-тителопродуцирующие клетки секретируют некоторое количество антител, которые присоединяются к окружающим клетку эритроцитам. Затем на чашки наслаивают раствор комплемента и снова инкубируют их прп 37° С. Комплемент диффундирует в агар и, связываясь эритроцитами, сенсибилизированными антителами, вызывает их лизис. При просмотре чашек невооруженным глазом будут видны круглые зоны просветления в агаре, число которых соответствует числу антителопродуцирующих клеток. Метод может быть применен для определения клеток, продуцирующих антитела против самых разнообразных антигенов. Антигены или гаптены при этом фиксируют на иоверхностп эритроцитов, засеваемых в агар. После связывания антител против соответствующего антигена эритроциты в присутствип комплемента лизируются (так называемый пассивный гемолиз). [c.260]

В последнее время к обычным методам анализа липидных антигенов, таким как пассивная гемагглютинация или торможение гемагглютинации, добавились методики, основанные на опосредованном комплементом лизисе липосом, содержащих антиген (Zemmour et al., 1984), и процедуры определения антител, связанных с иммобилизованным на твердой фазе липидным антигеном (Bro khaus et al., 1981 Kannagi et al., 1983). В этой главе мы рассмотрим только процедуры последнего типа. [c.159]

Рис. 9-2. Калибровочная кривая для определения теофиллина методом иммуноанализа с использованием липосом, содержащих фермент, и системы комплемента (Haga et al., 1981). Активность пероксидазы хрена, освободившейся при лизисе везикул, измеряли с помощью кислородного электрода.

При смешивании липосом с антителами и комплементом высвобождается заключенная в липосомы пероксидаза хрена, активность которой измеряют при помощи кислородного электрода. Свободный теофиллин, содержащийся в образцах, мешает связыванию антител с липосомами и, таким образом, снижает литическую активность системы комплемента. В результате уменьшается скорость расходования кислорода. Это позволяег построить калибровочную кривую для надежного определения свободного лекарственного препарата в интервале 4—40 нМ. (рис. 9-2). Важно, что высокая чувствительность достигается, при использовании дешевой электродной системы детектирования. Столь же обнадеживающие результаты были получены при анализе тироксина и IgG в сыворотке спектрофотометрическим методом на основе комплемента (Braman et al., 1984), Использованные липосомы были покрыты специфическими антигенами и содержали щелочную фосфатазу. Авторы показали, что результаты определения тироксина и IgG этим методом довольно-хорошо коррелируют с результатами радиоиммунологического-анализа. По-видимому, фермент, активность которого демаскируется комплементом, остается в данном случае внутри липосом, но они становятся проницаемыми для субстрата. [c.125]

Иммуноайализ на основе комплемента обладает тремя основными недостатками. Во-первых, при получении липосом нужно строго нормировать содержание препарата, придающего им чувствительность к лизису (как видно из рис. 9-3, одна молекула теофиллина должна приходиться на две молекулы фосфати-дилхолина). Это ограничивает применимость метода для определения других веществ. Анализ каждого нового вещества [c.125]

Изящный метод отбора колоний микроорганизмов или клеток в культуре, продуцирующих определенный антиген, связан с использованием индикаторных эритроцитов с закрепленным на их поверхности белком А. Такие клетки вносят в агар, на котором растет культура, одновременно с антисывороткой к нужному антигену и комплементом. Антитела через белок А связываются с поверхностью эритроцитов. В местах нахождения клеток, секретирующих антиген, он образует со связанными антителами иммунные комплексы. На них садится комплемент, что приводит в конце концов к лизису эритроцитов. Искомые колонии или клетки-продуценты антигена обнаруживаются по красным ореолам в местах их локализации [Smith, Hammarstrom, 1979]. [c.293]

Наиболее простой способ измерения активности комплемента состоит в определении концентрации сыворотки, вызывающей гемолиз 50 % клеток в стандартном препарате эритроцитов, сенсибилизированных антигеном (ЭСА). Реакцию проводят в пробирках или на микропланшетах. Для приблизительной оценки активности комплемента более удобен простой радиальный гемолиз. Этот метод сходен с простой радиальной иммун одиффузией, за исключением того что в лунки ВНОСЯТ исследуемую сыворотку, а гель содержит ЭСА. Вокруг лунки, содержащей активный комплемент, образуется зона гемолиза, величина [c.539]

Существуют также методы для определения различных отдельных компонентов комплемента по их содержанию или функциональной активности. Это важное различие, так как компонент может присутствовать в нормальном количестве, но быть функционально неактивным. Содержание (уровень) индивидуальных белков комплемента обычно определяют при помощи ралиоим-муноанализа (РИА) или ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), используя антитела, специфичные к данному белку. Для измерения функциональной активности в суспензию сенсибилизированных эритроцитов ВНОСЯТ все компоненты комплемента, необходимые для лизиса, за исключением исследуемого белка (рис. 29.18). [c.539]

Концентрация реагентов, при которой при температуре 73 С и ионной силе 0,043 происходит 50%-ная денатурация ДНК из бактериофага Т4 Е. oli (определенная методом фиксации комплемента) [c.266]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология