Антител флуоресцентный анализ

Рис. 11-2. Схема реакций, протекающих при гомогенном флуоресцентном иммуноферментном анализе с применением антител, меченных ферментом.

Рмс. 7.9-16. Флуоресцентный иммунный анализ с субстратом-меткой. Антитело, связанное с меченым гаптеном, ингибирует его как субстрат для фермента. [c.598]

Флуоресцентный анализ антител 0,45 Нитроцеллюлоза (черная мембрана) [c.222]

Неожиданное дополнительное преимущество применения импульсных лазеров для флуоресцентного анализа антител состоит в том, что импульсное возбуждение не приводит к затуханию свечения флуоресценции, даже если доза фотонов, получаемая образцом, в 10 раз больше дозы, которая приводит к затуханию флуоресценции при освещении обычными источниками [105, 107, 109]. Затухание флуоресценции представляет серьезную проблему в обычном анализе оно приводит к ошибкам в результатах и препятствует повторному анализу той же самой пробы прн оценке воспроизводимости анализа. Отсутствие затухания флуоресценции после импульсного освещения можно объяснить двухступенчатым процессом фотодиссоциации, на первой ступени которого образуется фоточувствительный промежуточный продукт. Если этот продукт образуется медленно, то в течение импульсного облучения он накапливается в незначительном количестве. [c.586]

Л. а. используют в иммунохим. анализе для определения антител, гормонов, лек. препаратов, вирусных и бактериальных антигенов по концентрации комплекса антиген-антитело. При этом в иммунном флуоресцентном анализе к антителу непосредственно присоединяют флуоресцирующие в-ва, напр. РЗЭ, флуоресцирующие красители (чувствительность метода 10" моль/л), а в иммуноферментном анализе к антителу присоединяют фермент и в результате ферментативной р-ции, сопровождаемой биолюминесценцией, определяют ферментативную активность (чувствительность метода 10" моль/л). [c.614]

Индикация образовавшегося комплекса антиген — антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных ком-, понентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов. [c.5]

Хотя в последние годы опубликовано немало статей, описывающих преимущества ФИА, соответствующие наборы и приборы стали выпускать в промышленном масштабе только недавно. Флуоресцентные метки значительно дешевле изотопных, срок годности наборов ФИА намного больше, чем наборов РИА, а флуоресценцию можно измерять на простых флуориметрах. Многие достоинства ФИА свойственны и методам ИФА (доступность методик ковалентного связывания ферментов с антигенами или антителами, стабильность меченых продуктов, безопасность и др.). Главный недостаток ИФА связан со способом измерения результата анализа, а именно с необходимостью дополнительной операции определения активности фермента с помощью соответствующего субстрата. Эта операция усложняет и замедляет анализ и в принципе может сни- [c.139]

Примеры использования иммунологических методов в биологическом анализе 263 Примеры использования радиоиммунологического анализа 269 Иммунологические методики для локализации веществ в клетках, тканях и молекулах флуоресцентные антитела и антитела, связанные с ферритином 272 Список литературы 272 Задачи 273 [c.577]

По данным электронной микроскопии, актиновые филаменты состоят из двух цепей глобулярных молекул, имеющих диаметр около 4 нм и образующих двойную спираль, на каждый виток которой приходится 13,5 молекулы (рис. 10-7 и 10-8). Эти цепи составляют основу тонких филаментов скелетных мышц, что следует из результатов рентгеноструктурного анализа и окрашивания 1-дисков флуоресцентными антителами к актину. Однако тонкие филаменты мьшщ состоят не только из актина-они содержат также несколько других белков (см. ниже, разд. 10.1.12). [c.79]

Для определения концентрации веществ в большинстве иммунохимических методов к анализируемому раствору, содержащему определяемое соединение и его меченый аналог, добавляют реагент в количестве, намного меньшем необходимого по уравнению (7.12). Как немеченые, так и меченые соединения взаимодействуют с реагентом практически одана-ково, поэтому отношение их концентраций будет одним и тем же в растворе и в связанном состоянии. При этом возможность применения метода во многом определяется доступностью меченого антигена и соответствующих антител. Для введения метки используют различные реагенты радионуклиды, ферменты, красящие вещества, флуоресцентные и хеми-люминесцентные зонды, ионы металлов. До последнего времени в качестве маркеров антител применяли радиоактивные изотопы этот метод назьшается радиоиммунохимическим анализом (РИА). При этом степень [c.298]

Существует много вариантов иммунохимического анализа. Одни из наиболее распространенных заключается а следующем. На диске из поливинилхлорида сорбируются немеченые антитела к исследуемому белку. Колонии прямо иа чашке Петри лизируются в мягких условиях, и поливинилхлоридный диск вводится в контакт с поверхностью чашки. Продукты с антигенными детерминантами исходного белка образуют комплексы антиген — антитело с антителами, сорбированными на диске только в местах положения экспрессирующих клонов. Затем диск отмывается от иеспецифи-чески сорбированного антигена и обрабатывается раствором с меченными (радиоактивно, флуоресцентно илн иммуноферментно) антителами. Эти антитела образуют комплекс с антигеном за счет его других антигенных детерминант, в результате чего участки диска, содержашие первый комплекс антиген — антитело, оказываются мечеными (рис. 256). По положению меченых участков на диске легко идентифицировать экспрессирующие колонии. [c.439]

Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой длины волны, более длинной. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Такой микроскоп похож на обычный световой микроскоп, но здесь свет от осветителя, излучаемый мощным источником, проходит через два набора фильтров - один для задержания света перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образна Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает на окуляр свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции (рис. 4-6). Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Например, флуоресцирующие красители могут быть связаны с молекулами антител, что сразу же превращает их в высокоспенифические и удобные красящие реагенты, селективно связывающиеся со специфическими макромолекулами на поверхности живой либо внутри фиксированной клетки (см. разд. 4.5.3). Для этой цели обычно используют два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом (рис. 4-7). Применяя [c.177]

При крайне низких концентрациях компонентов образование простого бинарного комплекса антиген-антитело не может быть за регистрировано ни визуально, ни простыми инструментальным методами, что вызывает необходимость усложнения аналитическо системы. Одним из путей визуализации образования комплекс является использование меченых соединений, в которых метка мо ет легко детектироваться в концентрациях, сопоставимых с опре деляемой концентрацией анализируемого соединения. Как правило от типа метки зависит название анализа — радиоиммунологически анализ, флуоресцентный иммуноанализ, иммунокофакторный ана ЛИЗ, иммуноферментный анализ и т. д. [c.78]

Основные задачи флуоресцентного иммуноанализа. Одной из главных задач иммуноанализа является разработка простых гомогенных (безразделительных) методик, выгодно отличающихся от традиционных гетерогенных- (с операциями разделения). Последние включают операцию разделения свободных антигенов от связанных с антителами эта операция увеличивает продолжительность анализа и может быть источником ошибок. Другой целью новых методик иммуноанализа является ускорение достижения равновесия в системе, что сокращает время, необходимое для проведения анализа. Одно из основных преимуществ флуоресцентного иммуноанализа (ФИА) увязано с возможностью определения самых разнообразных веществ некоторые из них указаны в табл. 10.1. [c.139]

Быстрое развитие иммунологии нашло свое отражение в данной, третьей книге из серии Иммунологические методы , которая включает изложение экспериментального опыта, накопленного в Базельском институте иммунологии. В нее входят пять глав, посвященных применению рекомбинантных ДНК в иммунологии в двух главах описано использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для разделения белков отдельные главы касаются следующих вопросов применение моноклональных антител для идентификации мембранных антигенов лимфоцитов, типирование антигенов гистосовместимости, новые методы анализа белков с помощью двумерного электрофореза, лимфокины, поддерживающие рост В-клеток. В четырех главах описано получение и ведение линий клонированных В- и Т-кле-ток и гибридом, а еще в четырех обсуждаются новые методы детектирования клеток, продуцирующих ревматоидный фактор. Две главы посвящены таким общим иммунологическим методам, как флуоресцентный сортинг клеток и анализ методом лимитирующих разведений, и наконец, четыре последние главы касаются сложных методов, используемых при работе с определенными видами животных (птицами, овцами и амфибиями) для изучения специальных иммунологических вопросов. [c.7]

Используя те же клетки, можно начинать культивирование с клонирования одиночных клеток или проводить анализ методом лимитирующего разведения. В ряде случаев популяцию предшественников В-клеток обогащают или даже выделяют их в чистом виде с помощью положительной селекции, применяя моноклональные антитела к антигенам В-220, АА4.1 или GF1.2. При этом используют методики адсорбции на чашках (пен-нинг), образования розеток или применяют флуоресцентный клеточный сортер. Одиночные клетки можно поместить с помощью микроманипуляций в круглодонные лунки микропанелей и культивировать их в 200 мкл WEHI-K или в присутствии очищенного ИЛ-3. При этом среду меняют каждые 3 ср и положительные культуры размножают в лунках панелей Limbro и во флаконах для тканевых культур. [c.310]

Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортинге клеток, должен быть тщательно очищен. [c.332]

Требования к аналитическим системам, поступающим в продажу, постоянно возрастают. Безусловно, флуоресцентные методы ИФА могут им удовлетворить. Новые методы должны быть скоростными, универсальными и простыми при низкой стоимости. Достижению этих целей может способствовать автоматизация. Предстоит еще изучить применение различных ферментов и флуорофоров, средств автоматизации и схем анализа. Метод, описанный в этой главе, представляет собой шаг в этом направлении. Разработанный нами бесконкурентный метод связан с использованием меченых антител и новой пары краситель— фермент. Время анализа составляет 60 с, стоимость реагентов для одного определения — меньше восьми центов. Анализ основан на одноточечном измерении и выполняется автоматически с помощью проточно-инжекционной системы. [c.169]

Отсюда, при фиксированной концентрации антитела, равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена количественно связано с общей концентрацией лиганда. Это соотношение лежит в основе любого иммуноанализа. Таким образом, если ввести в анализируемую систему фиксированное количество меченого антигена, то можно определить и неизвестную концентрацию антигена. Неизвестную концентрацию антитела определяют при помощи меченых антител. Для введения метки в антитело или антиген можно использовать различные метящие агенты, такие, как радионуклиды, ферменты, красные кровяные клетки, флуоресцентные и хемилюминесцентные зонды или металлы. В радиоиммуноанализе (РИА) и иммуно-ферментном анализе (ИФА) метят антиген, а в иммунорадиометрическом (ИРМА) и иммуноферментометрическом (ИФМА) анализе - антитело. В большинстве методик иммунного анализа требуется порознь определять связанный и свободный меченый антиген или антитело. Поэтому эти методики довольно громоздки и длительны. [c.57]

Рассмотренные системы НПВОФ базируются на детектировании флуоресцентного сигнала под прямым углом. Можно использовать и детектирование по ходу отраженного пучка (рис. 33.1,г). Для детектирования сигнала в этом режиме в работах [8, 46] использовали как кварцевые пластинки, так и кварцевые оптические волокна. Для иммунофлуоресцентного анализа по двухцентровой реакции предел обнаружения IgG после десятиминутной инкубации с FIT -антителами достигает 3,0 и 1,5 мкг/мл для плоских и волоконных волноводов соответственно. [c.533]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология