Миеломные клетки, слияние

В ряде случаев для определения частоты соматического мутагенеза необходимо исследовать огромное число клеток, экспрессирующих один и тот же V-ren. Практический подход для идентификации такой группы состоит в характеристике иммуноглобулинов, получаемых от серии клеточных линий, осуществляющих иммунный ответ на одинаковый антиген. (Используемые для этой цели антигены представляют собой маленькие молекулы, имеющие дискретную структуру, которая, по-видимому, обусловливает стойкий иммунный ответ. Они отличаются от больших белков, отдельные части которых могут стимулировать образование разных антител. Эти маленькие молекулы получили название гаптенов. Для того чтобы придать им свойства антигена, их соединяют с инертным белковым носителем. Иммунизируя таким антигеном мышь, получают реактивные лимфоциты, которые соединяют путем слияния с миеломными клетками для получения гибридом. Такие гибридные клетки продолжают независимый синтез желаемого антитела.) [c.515]

Родительские миеломные клетки и сами гибридомные клетки могут храниться в жидком азоте в течение длительного времени (в течение 10 лет определенно). Процедура замораживания проста, но ее следует опробовать на родительских клетках до слияния. При замораживании используют специальную смесь. Поскольку смеси, пригодные для клеток других типов, в случае гибридом не работают, остановимся на следующем методе. [c.194]

Токсичность ПЭГ можно проверить в предварительных экспериментах. Для этого обрабатывают раствором ПЭГ миеломные клетки при таких условиях, в которых будет проводиться слияние, затем засевают обработанные клетки в культуру при низкой плотности и сравнивают их рост с ростом необработанных клеток. [c.99]

Очень часто неудачи в получении гибридом при слиянии связаны с микоплазменной инфекцией. Клетки, зараженные микоплазмой, не растут на среде ГАТ. Перед слиянием миеломные клетки должны быть проконтролированы на отсутствие микоплазм (см. статью Г. Г Миллер и др. в наст. сб.). Микробиологический контроль периодически должен осуществляться и при длительном пассировании гибридом. Микоплазменная инфекция может угнетать рост клеток вплоть до их полной дегенерации. [c.205]

Еще с прошлого столетия известно, что моча больных, страдающих этим заболеванием, часто содержит необычные белки, названные белками Бенс-Джонса по имени английского врача, который их впервые описал. Однако только в 1950-х годах выяснилось, что эти белки представляют собой свободные L-цепи иммуноглобулина. Первоначально детальная структура антитела была определена путем изучения миеломных белков из мочи или крови больных или же белков от мышей, у которых были целенаправленно индуцированы аналогичные формы рака. Впоследствии появилась возможность делать В-клетки, секретирующие антитела, бессмертными путем их слияния с клетками миеломы, не секретирующими антитела. Образующиеся гибридомы стали удобным источником моноклональных антител, которые можно получить против любого желаемого антигена в неограниченном количестве (разд. 4.5.4). [c.238]

Подготовка миеломных клеток. При выборе миеломных клеток следует основываться на данных табл. 8. Необходимо учесть, что клеточные линии изменяются и иногда их способность к слиянию падает или же синтез антител гибридными линиями становится нестабильным. Поэтому лучше иметь не одну какую-то линию клеток, а по крайней мере три. Первые опыты по слиянию нужно провести со всеми линиями, и клетки, которые дали наилучшие результаты, заморозить в достаточном количестве. [c.104]

Клетки питающего слоя можно добавлять либо вместе со смесью миеломных и селезеночных клеток, обработанных поли-этиленгликолем, либо за сутки до слияния, либо через сутки после него. [c.105]

Клетки из селезенки мышей, предварительно иммунизированных антигеном, гибридизуют с клетками миеломной линии, растущей в культуре. Слияние индуцируют вирусом Сендай (о приготовлении вируса см. гл. 30). [c.402]

Обработка полиэтиленгликолем облегчает слияние клеток, тем не менее слияние происходит редко и является в достаточной степени случайным событием. В смеси присутствуют клетки миеломы, селезенки, а также слившиеся клетки миеломы-селезенки, миеломы-миело-мы, селезенки-селезенки. Однако в среде ГАТ растут только гибридные клетки миеломы-селезенки, все остальные типы клеток не могут в ней пролиферировать. Клетки селезенки и слившиеся клетки селезенки—селезенки вообще не растут в культуре, а миеломные клетки НОРЕТ и слившиеся клетки миеломы—миеломы не могут использовать гипоксантин в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот. Но у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - при участии дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, ингибирующий активность этого фермента. Таким образом, миеломные клетки [c.185]

Гибридомы человека получают аналогично гибридомам мыши. В большинстве случаев сливают с помощью ПЭГ активированные В-клетки либо с миеломными клетками, дефективными по ГГФРТ, либо с клетками, у которых нет этого дефекта, применяя в данном случае селективную среду с диэтилпирокарбо-натом. Для индукции слияния некоторые исследователи используют электрический разряд. [c.120]

Другой особенностью используемых для гибридизации клеток миелом является отсутствие у них фермента гипоксантинфосфори-бозилтрансферазы, участвующего в синтезе ДНК- Этот фермент обеспечивает запасный путь синтеза аденозинмонофосфата в тех случаях, когда нормальная цепь ферментативных реакций заблокирована (например, в присутствии ингибитора — аминоптерина). На питательной среде, содержащей гипо-ксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-сре-да), такие миеломные клетки размножаться не способны. Вторым партнером для слияния служат иммунные лимфоидные клетки селезенки или лимфоузлов, которые сами по себе нежизнеспособны в культуре. Сомати- [c.164]

Новые колоссальные возможности для иммунохимических исследований появились в последние годы, когда было обнаружено, что соматические гибридные клетки, полученные от слияния in vitro клеток миеломы с другими клетками-продуцентами антител, наследуют от первых способность пролиферировать, а от вторых — способность к синтезу специфических для них антител. Таким образом, миеломные клетки передают гибриду свою способность делиться и вести интенсивный синтез иммуноглобулинов, в то время как генетическая информация для этого синтеза поступает от обеих клеток-—миеломной и ее партнера по гибриду. Такие гибридные клетки ( гибридомы ) могут размножаться in vitro, вырабатывая большие количества антител. Их можно размножить и путем трансплантаций в организме мыши. Мало того, удается отобрать такие исходные варианты миеломы или такие продукты гибридизации, что синтез собственных мие- [c.104]

Получение mAb. Ключевая идея, лежащая в основе получения mAb (Г. Колер и С. Мильштейн, 1975 г.), как и всё гениальное, очень проста сделать бессмертным В-лимфоцит, который исходно синтезирует антитела одного вида и специфичности, но сам по себе может совершать в культуре лишь ограниченное число делений в течение 10-14 дней культивирования. Практически это достигается путем слияния первичных В-лимфоцитов, секре-тирующих антитела, с опухолевыми миеломными клетками, которые данной способностью не обладают, но могут неограниченно долго делиться в культуре. В результате образуются гибридные клетки (гибридомы), которые приобретают от одной из исходных клеток способность продуцировать антитела требуемой специфичности, а от другой - способность к продолжительному росту и делению в культуре. Реализация данной схемы начинается с иммунизации экспериментальных животных, как правило мышей, антигенами, против которых предполагается получать антитела. Иммуногенами могут быть препараты очищенных макромолекул, их различные смеси, а также целые клетки или субклеточные структуры. После достижения антителами в сыворотке крови мышей необходимого титра селезенку иммунизированных животных используют в качестве источника В-клеток, продуцирующих искомые антитела. [c.404]

Животных (обычно мышей или крыс) иммунизируют антигеном. Когда продукция антител достигает высокого уровня, из селезенки животных (могут быть использованы и лимфоузлы) готовят суспензию клеток. Затем вызывают слияние спленоцитов с клетками ми-еломной линии, применяя для этой цели полизтиленг-ликоль (ПЭГ) — агент, способствующий слиянию клеточных мембран. Процесс проходит успешно лишь у небольшого числа клеток. Клеточную смесь, содержащую слившиеся клетки, культивируют в ГАТ - среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин является высокотоксичным агентом, блокирующим один из метаболических путей - синтез пуринов. Клетки могут использовать обходный метаболический путь, если в среде присутствуют его интермедиаты - гипоксантин и тимидин. Спленоциты способны расти в ГАТ-среде, однако миеломные клетки в ней погибают, так как имеют метаболический дефект. не позволяющий использовать обходный путь синтеза пуринов. Клеточная суспензия, вносимая в ГАТ-среду, содержит спленоциты, клетки миеломы и слившиеся клетки. Спленоциты погибают в культуре естественным путем через 1-2 нед, клетки миеломы не выживают в ГАТ, слившиеся же клетки сохраняют жизнеспособность, поскольку сочетают свойства бессмертной миеломы и клеток селезенки, использующих обходный метаболический путь. Некоторые из слившихся клеток сохраняют также способность про- [c.537]

Гибридомы — гибридные лимфоидные клетки, полученные путем слияния опухолевой миеломной клетк , с нормальными лимфоидными клетками иммунизированного животного или человека. [c.494]

Миеломные клетки культивируют на среде Игла в модификации Дальбекко (ОМЕ) или на среде ЙРМ1-1640 с добавлением 10 % эм-бринальной сыворотки коров. Плотность насыщения для этих клеток— (1.0—1.5) 10 клеток на 1 мл. Растут они, частично при-крелляясь к подложке, частично в суспензии. Для слияния используют клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. [c.196]

Метод генетической инженерии позволяет также заменить многие методы, основанные на получении продуктов in vivo, на способы получения этих продуктов in vitro. До последнего времени диагностические, лечебные и профилактические сыворотки получали из крови иммунизированных лошадей или вакцинированных людей-доноров. В настоящее время этот дорогой и непростой способ вытесняется гибридомной техникой получения антител. Эта техника основана на получении клеток-гибридом путем слияния В-лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных и миеломных (раковых) клеток. Образующаяся гибридная клетка (гибридома) обладает способностью миеломной клетки быстро размножаться на искусственных питательных средах [c.104]

После иммунизации, даже монодетерминантным антигеном, в пуле иммуноглобулинов, синтезируемых совокупностью клеток, содержатся антитела, различающиеся между собой, т. е. сыворотки содержат поликлональные антитела. Эта гетерогенность антител обусловлена тем, что каждый плазмоцит вырабатывает только один тип, вид, класс, подкласс антител. Следовательно, каждая клетка или ее потомство, клон вырабатывают свой тип антител, получивших название моноклональных. Принципиально моноклональные антитела можно получить искусственно, культивируя каждую антителопродуцирующую клетку, т. е. получая моноклональную культуру клеток. Однако практически это трудно осуществимо. Поэтому гибридную клетку получают путем слияния иммунного антителопродуцирующего В-лимфоцита, т. е. лимфоцита, взятого от иммунного животного и раковой миеломной клетки. Такая гибридома приобретает свойства ро- [c.156]

На иммунизацию организм отвечает синтезом очень неоднородной популяции антител, молекулы к-рых могут сильно отличаться друг от друга по сродству к антигену. Такая неоднородность объясняется участием в иммунном ответе очень большой популяции В-лимфоцитов, каждый из к-рых синтезирует лишь одну разновидность молекул антител. С помощью техники гибридом (гибридные клетки, получаемые слиянием злокачественных и нормальных анти-телобразующих клеток лимфоцитов) удается получить в больших кол-вах однородные моноклональные антитела, к-рые широко используют в качестве высокоспецифич. реагентов для обнаружения, локализации и выделения разл. в-в, а также для диагностики и лечения нек-рых заболеваний. Гомог. И. накапливаются в больших кол-вах в крови и моче больных при ряде злокачеств. поражений лимфоцитов (т. наз. миеломные И.). [c.217]

Моноклональные антитела (Mono lonal antibodies) Однотипные антитела, строго специфичные в отношении одного эпитопа (антигенной детерминанты). Синтезируются гибридомами - клеточными гибридами, полученными при слиянии нормальных антителообразующих клеток с миеломной опухолевой клеткой, способной к неограниченному росту. Некоторые мие- [c.553]

Антитела составляют фракцию гамма-глобулинов сыворотки крови, называемую еще иммуноглобулинами. Известно 5 типов иммуноглобулинов. Получение чистых антител из иммуноглобулиновой фракции до недавнего времени было труднодоступно. Однако в 1975 г. Мнльштейн и Коллер сделали важное открытие, установив, что В-клетки, продуцирующие только один вид антител, могут сливаться с клетками миеломы. В то время как В-клетки не могут быть выращены в виде культуры, клетки миеломы в культуре растут и размножаются. Среди образующихся в результате слияния гибридных клеток, называемых гибридомами, обнаруживаются клетки, сохранившие способность образовывать те же самые антитела, что и В-клетки, использовавшиеся для получения гибридом. В то же время эти гибрид омы сохраняют бессмертный характер миеломных клеток. Таким образом, было осуществлено клонирование гибридомных клеток, полученных на основе В-клеток, способных синтезировать определенный вид антител, что дало возможность получать неограниченное количество таких антител. [c.315]

На следующем этапе смешивают примерно 10 миеломных клеток с 10 клеток селезенки. Клетки в среде без сыворотки выдерживают 45 мин., центрифугируют в конических пробирках. Супернатант удаляют, осадок встряхивают и к нему добавляют 2 мл. 40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с ММ примерно 1,5—4,0 кДа, померживают температуру 37°С, pH среды 7,6—7,8, выдерживают 30 мин., затем в течение последних 7—8 мин. добавляют среду Дальбекко с фетальной телячьей сывороткой (5—15%). Клетки в разведенном ПЭГ осаждают, ресуспендируют в 30 мл. гибридомной среды с сывороткой и распределяют в лунки объемом 2 мл для микротитрования. При необходимости среду заменяют на свежую (среда с гипоксантином и тимидином). В среду добавляют клетки-фидеры, или "кормилки" (от англ. feeder — приток, питатель) — преимущественно перитонеальные макрофаги, индуцированные минеральными маслами) и 1% карбоксиметилцеллюлозу. В качестве индукторов слияния клеток можно использовать вирус Сендай, температурный шок, электроразряд и др. [c.574]

Рис. 163. Схема получения моноклональных антител с помощью габридом-ной техники АС — агент слияния клеток, 1 —В-клетки из селезенки иммунной мыши, 2 — культура миеломных клеток мыши, 3 — гибридизация, 4 — гибридомы, 5 — селекция и клонирование гибридом, 6 — гибридомы, образующие моноклональные антитела, 7 —- введение гибридом, образующих моноклональные антитела, в организм сингенной мыши, 8 — клетки гибридомы, образующие моноклональные антитела, культивируемые в виде культуры ткани, 9 — выращивание гибридомных клеток, образующих моноклональные антитела, в ферментаторе, 1дкж — иммуноглобулины в культуральной жидкости, 1дас — иммуноглобулины в асцитической жидкости, 10 — высаливание 1д-ов аммония сульфатом, 11 — стандартизация 1д-ов, 12 — лиофили-зация 1д-ов.

Линии клеток, продуцирующих моноклональные антитела, обычно получают от грызунов, например мышей и крыс, дающих хороший иммунный ответ на иммуноген. Готовят суспензию клеток селезенки этих животных и вызывают их слияние с мие-ломными клетками. Полученные в результате слияния клетки обладают свойствами и тех, и других родительских клеток, сочетая в себе способность к неограниченному размножению, свой-ствеипую миеломным родительским клеткам, со способностью продуцировать специфические антитела, присущей В-лимфоци-там селезенки. Выделение клона клеток, продуцирующих одно антитело, позволяет нарабатывать эти моноклональные антитела в больших количествах. [c.180]

Гибридомы человека секретируют очень низкий уровень антител (50 НГ — 10 мкг/мл) в основном IgM класса. Это может быть связано с особенностями родительских миеломных линий человека, выбранных для слияния. Имеющиеся в настоящее время линии человека не являются истинными плазматическими клетками, как в случае миелом мыши, а принадлежат скорее всего к менее дифференцированным лимфобластоидным клеткам. [c.120]

Гкбридома — гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния антителопродуцирующей клетки с миеломной, активно пролиферирующей клеткой, у которой отсутствует собственный синтез иммуноглобулинов гибридома образует высокоаффинные антитела узкой специфичности. [c.460]

Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на НАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с кислой фосфатазой простаты человека и поверхностным антигеном гепатита В. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам. Гибридные антитела, взаимодействующие с пероксидазой и соматотропи-ном, были успешно использованы для изучения локализации сома-тотропина в клетке. [c.166]

В 1975 г. Колер и Милстейн опубликовали сообщение о разработке гибридомно14 технологии для получения моноклональных антител, способных распознавать специфические, специально выбранные антигены. В первоначальном варианте для получения гибридом осуществляли слияние клеток селезенки иммунизированных мышей с линие11 миеломных клеток того же вида, используя вирус Сендай [1]. Потом в качестве агента, обеспечивающего слияние клеток, стали применять полиэтиленгликоль (ПЭГ) [2 ]. Далее было показано, что клетки селезенки могут быть иммунизированы in vitro за несколько дней до слияния, что позволяет преодолеть ряд потенциальных проблем, связанных с иммунной толерантностью и биологическим разрушением иммуногена [3]. Технические аспекты наиболее часто используемых методик детально описаны в работах [4-7 ]. [c.37]

Инактивированный вирус разводят в сбалансированном растворе Эрла до 4000 ГАЕ/мл (2 части вируса-ЬЗ части раствора Эрла), ампулируют по 1,1 мл, мгновенно замораживают в смеси твердой СОг с этанолом и хранят при —70°С. Для того чтобы произошли клеточные слияния во взвеси, содержащей 10 миеломных и 10 селезеночных клеток в 1 мл, требуется 1000— 2000 ГАЕ/мл вируса, что составляет примерно 360 вирионов на одну клетку. [c.401]

ДОВ ЯВЛЯЮТСЯ результатом слияния миеломных клеток с В-клетками селезенкн. [c.406]

Эффективно продуцировать моноклональные антитела могут любые В-клетки, необходимо лишь сделать их для этого бессмертными и пролиферирующими. Чаще всего для этой цели получают гибридные клетки — путем слияния мышиных спленоцитов с миеломными В-клетками от мышей той же линии, не секретирующими собственных антител. Возможно также получить межлинейные или межвидовые гибриды, однако они часто нестабильны. Другой метод имморта-лизации — это трансформация клеток, например в случае В-клеток человека путем инфицирования вирусом Эпштейна—Барр. [c.537]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология