Клетки методы гибридизации

Еще 15 лет назад был разработан метод гибридизации соматических клеток для проведения генетических исследований на клеточных культурах. На его основе была создана методика генетической рекомбинации путем искусственно вызываемого слияния протопластов ее уже удалось с успехом применить на материале грибов и растений. Первичный продукт такого слияния-клетка, объединяющая в себе геномы обеих родительских клеток. [c.471]

ДНК-зонды применяют и в реакциях гибридизации с РНК до выявления экспрессии данного гена в клетках. В этом случае ДНК-зонд. содержащий часть носледовательности гена, пытаются гибридизовать с РНК, выделенной из анализируемой клетки. Если гибридизация происходит, проводят количественное определение экспрессии. Более усовершенствованные методики предполагают обработку ДНК-зонда специфическими нуклеазами для обнаружения участков, гибридизующих с клеточной РНК. Таким образом можно определить начальные и концевые участки транскриптов РНК (рис. 4-71) этот же метод может быть полезен для выяснения точных границ участков, вырезаемых из транскриптов РНК в процессе сплайсинга РНК. [c.238]

Геномы эукариот содержат не только интроны, но также и большое число копий ДНК, которая не кодирует белок и представляется ненужной. Присутствие таких повторяющихся последовательностей ДНК у высших эукариот впервые было обнаружено методом гибридизации, позволяющим оценить число копий гена (см. разд. 4.6.7). При иснользовании этого метода геном механически нарезается на короткие двухцепочечные фрагменты длиной около 1000 нуклеотидных пар затем фрагменты подвергают денатурации и получают одноцепочечную ДНК. Скорость, с которой одноцепочечные ДНК гибридизуются в смеси, зависит от комплементарности фрагментов. Для большей части фрагментов реакция протекает очень медленно. Например, гаплоидный геном клетки млекопитающего представлен примерно 6 млн различных фрагментов ДНК длиной 1000 нуклеотидов, и любой фрагмент, последовательность которого содержится лишь в одной копии, должен случайно столкнуться с 6 млн некомплементарных цепей, чтобы наш гомолога. [c.242]

Метод гибридизации клеток позволяет изучать и локализовать гены, продукты которых можно идентифицировать как в клетках человека, так и в клетках животных. Один из путей идентификации - использование селективной системы. [c.201]

С другой стороны, авторы использовали клетки селезенки мыши, иммунизированной эритроцитами барана. Клетки селезенки не жизнеспособны в культуре —они тоже не размножаются (тем более на НАТ-среде). Далее с помощью убитого вируса Сендай осуществляли соматическую гибридизацию клеток миеломы и селезенки. На методе гибридизации с использованием вируса Сендай останавливаться не будем, поскольку его вытеснила описанная ниже более простая техника. [c.113]

Метод гибридизации ДНК и иммунологические методы позволяют идентифицировать многие гены и их продукты. Если при этом искомый ген кодирует фермент, не синтезируемый клеткой-хозяином, то для обнаружения клонов, содержащих данный ген, можно использовать метод идентификации на чащках. Так были идентифи- [c.69]

Поскольку нуклеотидный состав рибосомной РНК не коррелирует с нуклеотидным составом ДНК в тех же клетках, казалось сомнительным, чтобы и рибосомная РНК действительно образовывалась на ДНК-матрице. Однако, как показали Яновский и Спи-гелман [61—64] методом гибридизации, рибосомная РНК представляет собой продукт транскрипции лишь небольшой части ДНК бактериальной клетки [61—64]. Яновский и Снигелман выбрали организмы, ДНК которых резко отличается по составу от рибосомной РНК, пометили их РНК с помощью Р или Н и позволили затем клеткам находиться на нерадиоактивной среде еще некоторое время. За этот период метка исчезала из быстро метящейся т.-РНК и накапливалась в стабильной г-РНК. Затем дали возможность образоваться гибридам, после чего удалили РНК-азой всю негибридизированную РНК и выделили устойчивые к РНК-азе гибриды. Оказалось, что только менее 0,4% всей ДНК комплементарно РНК из 16S- и 238-рибосом. Нерибосомная РНК из данного организма не конкурирует за эту фракцию ДНК. Более того, сами г-РНК из 16S- и 238-рибосом берут начало от различных участков ДНК. Это предположение основано на следующих фактах во-первых, максимальное количество РНК, способное образовать гибрид с ДНК, различно для этих двух РНК. Во-вто-рых, когда / -РНК из 168- и 238-рибосом присутствуют одновременно в насыщающих концентрациях, то образование гиб- [c.239]

Любая клонированная ДНК может быть получена в огромных количествах, что дает возможность выделить соответствующую мРНК, используя для этого метод гибридизации. С помощью такого методического приема можно выделить мРНК, представленные всего лишь несколькими копиями в клетке, тогда как непосредственно, без применения техники клонирования, могут быть получены лишь те мРНК, которые присутствуют в относительно больших количествах. [c.122]

В опытах по трансфекции массу добавленной к реципиентным клеткам ДНК обычно увеличивают за счет избытка ДНК-носителя, препарата какой-то другой ДНК (например, ДНК спермы лосося). Доказано, что трансфицируемые клетки получают ДНК-носитель в виде последовательностей, фланкирующих селектируемые с каждой стороны. Следовательно, трансфекция осуществляется структурой ДНК, состоящей из ряда сцепленных последовательностей всех типов, присутствующих в препарате донора. Поскольку ревертанты по селектируемому маркеру утрачивают весь этот материал, кажется вероятным, что трансфицируемые клетки приобретают только одну такую структуру ДНК. Данная структурная единица может образовываться благодаря конкатемерному сцеплению донорных последовательностей в ходе реакции, которая проходит очень быстро по сравнению с другими событиями, вовлекаемыми в процесс трансфекции. Такая трансфицируемая единица может иметь протяженность около 1-10 п.н. Мы не можем установить с помощью метода гибридизации, сцеплена ли донорная единица с хромосомной ДНК реципиента (интересующие нас концевые фрагменты представлены в слишком незначительных количествах). Вероятно, что первая стадия процесса заключается в образования нестабильных внехромосомных единиц, которые впоследствии стабилизируются в результате интеграции. В некоторых клеточных линиях методом гибридизации in situ было показано, что трансфицированные клетки содержат донорный материал, интегрированный в хромосомы хозяина. Любая определенная клеточная линия имеет только один сайт интеграции однако сайты в каждой линии различны. Вероятно, выбор сайта для интеграции - случайное событие иногда оно связано с большими хромосомными перестройками. [c.500]

Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в отдельных нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах, узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповидноклеточной анемии происходит замена АТ на ТА в шестой паре нуклеотидов гена, кодирующего Р-цепь гемоглобина человека замена происходит в сайте (СТКАО), чувствительном к рестриктазе Ойе (рис. 9.19). Фрагменты ДНК, возникающие под действием Ос1е1 у здорового человека и больного серповидноклеточной анемией можно сравнить с помощью метода гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда радиоактивно меченную ДНК гена Р-глобина, как это показано на рис. 9.19. Таким способом можно определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки, взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают анализу. Такая диагностическая процедура может производиться в тех случаях, когда существует подозрение, что оба родителя-носители вредного рецессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредные мутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазами. Однако иногда такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной диагностике. [c.288]

Помимо привычных методов гибридизации современный селекционер может воспользоваться для улучшения растительных культур методами молекулярной генетики. К их числу относятся введение в растительную клетку новой генетической информации с помощью плазмид, отбор новых типов из изолированных протопластов и соматическая гибридизация протопластов. Человек выращивает для своих нужд лишь небольшое число растений, а между тем существует множество еще неизученных растений, которые можно было бы широко использовать. К числу наиболее многообещающих видов относятся гваюла, дающая каучук, хохоба, дающая воск и масло, ЕсЫпосМоа, выращиваемая на зерно, и спаржевый горох, используемый для получения растительного белка. Новые методы разведения растений с применением тканевых культур и регулируемого воспроизведения могут быть полезны также и в лесоводстве. [c.527]

Вскоре и биохимические, и цитогенетические методы стали вместе использоваться в генетике соматических клеток. Появилась возможность выявлять специфические дефекты ферментов в отдельных клетках, растущих в культуре ткани. Разработка Генри Харрисом [254] и Эфрусси [247] методов гибридизации клеток человека с мышиными клетками позволила установить локализацию многих генов и построить хромосомные карты человека, которые уже соперничают в своей полноте с аналогичными картами для дрозофилы (разд. 3.4.3) и мыши (приложение 9). [c.32]

Харрис и Воткинс (1965) [254] повысили частоту слияния различных клеток путем воздействия вирусом Сендай, предварительно инактивированным ультрафиолетом. С помощью этого метода им удалось показать, что слиться могут клетки самых разных видов организмов и что слившиеся клетки жизнеспособны. С этой работы началось широкое использование метода гибридизации клеток в различных областях клеточной биологии. [c.200]

При классической фенилкетонурии, при которой фермент не выявляется в амниотических клетках, возможна диагностика с помощью метода гибридизации ДНК (метод сцепления с ДНК-мар-керами). [c.159]

В лаборатории А. Д. Мирзабекова с помощью описанного выше метода гибридизации с тенями гистонов (см. разд. 4.2) показано, что регуляторная область гена теплового шока дрозофилы не содержит ни гистона Н1, ни гистоиов сердцевины диагонали, соответствовавшие комплексам ДНК с гистонами, совсем не гибридизовались с пробой, содержавшей регуляторную область. Интересно, что даже в клетках, где транскрипция генов теплового шока не идет и где все три диагонали (ДНК, ДНК+ги-стоны сердцевины и ДНК+гистон Н1) нормально связываются с ДНК самого гена, гибридизация с пробой из регуляторной области выявляет только диагональ свободной ДНК. Постоянное существование свободной от гистонов регуляторной области у генов теплового шока связано с тем, что эти гены потенциально активны, — они немедленно включаются под воздействием теплового шока или другого стресса. [c.164]

У высших организмов большие перспективы для переноса чужеродной наследственной информации открываются в результате разработки метода гибридизации клеток. Недавно доказана возможность трансгеноза с помощью ДНК, выделенной из клеток и освобожденной от примесей (рис. 70). На искусственной среде выращивали клетки зародыша цыпленка. В определенный момент к ним добавляли бромдезоксиуридин, который включался во вновь синтезированные нити ДНК- По этой метке новые синтезированные за время наблюдения нити ДНК можно было отличить от старых. В эту среду одновременно добавляли ДНК, полученную от мыши и меченную тритием ( Н), что позволяло отличить ДНК мыши от ДНК цыпленка, которая или содержала, или не содержала в качестве метки бром. Через некоторое время после размножения клеток из них выделяли ДНК и выявляли в ней распределение меток по брому (ДНК цыпленка) и тритию (ДНК мыши). При этом обнаруживался обмен кусочками их ДНК ДНК мыши включалась в ДНК цыпленка н наоборот. [c.172]

Потенциальные возможности метода гибридизации клеток огромны. Его применяют не только для изучения проблем биологии развития. Представьте себе, папример, как много этот метод может дать для изучения генетики человека. Можно взять клетки у людей, страдающих генетически обусловленными заболеваниями. Используя метод гибридизации клеток и изучая образующиеся гибридные кдоны, можно определить число различных генов, ответственных за некоторые болезни (болезнь Дауна, гемофилия, галактоземия, диабет и др.), и их локализацию в хромосомах. Таким образом, можно проводить скрещивание у человека, не скрещивая людей. К моменту написания этой книги методом соматической ги ридизации уже идентифицировано 16 генов человека. Есть ли еще более привлекательная область исследования лля молодых ученых, чем эта [c.229]

Первоначально метод гибридизации in situ был наиболее успешно применен для выявления нуклеиновых кислот, находящихся в клетках в большом количестве копий. Этим методом выявляли, например, повторяющиеся последовательности сател-литных ДНК, амплифицированные рибосомальные ДНК в ооци-тах амфибий, латерально амплифицированные ДНК в политен-ных хромосомах двукрылых, рибосомальную и 5S РНК. Более того, с помощью этой же техники были идентифицированы и локализованы накапливающиеся в клетках транскрипты генов. [c.305]

Для соматических клеток уже в 60-х гг., т.е. в самом начальном периоде развития генетики соматических клеток, для проведения генетического анализа, был предложен своеобразный метод парасексуального процесса (Barski et al., 1960, 1961). Оказалось, что при совместном культивировании, клетки разных линий способны сливаться, образуя двуядерные и многоядерные гетерокарионы. В конечном счете возникают две одноядерные дочерние клетки, содержащие хромосомы, полученные от исходных родительских клеток, которые во многих случаях могут дать начало длительно раз-множаюш имся гибридным клеточным линиям. Такие гибриды могут содержать полный набор хромосом одной из исходных клеток и одну или несколько хромосом из другой. Такие гибридные клетки служат мощным орудием исследования функций индивидуальных хромосом. Методы гибридизации получили широкое распространение и стали совершенствоваться во всех лабораториях, изучающих генетику соматических клеток. В Советском Союзе гибридизация соматических клеток впервые была осуществлена в Лаборатории соматических клеток ИАЭ (Волкова, Какпакова, 1972). [c.252]

Молекулярно-биологические методы позволяют определить экспрессию цитокиновых генов в исследуемом материале, т. е. присутствие соответствующей тРНК. Как правило, гены цитокинов не экспрессируются конститутивно, транскрипция этих генов регулируется соответствующими индуцирующими молекулами. Кроме того, тРНК очень короткое время присутствует в клетке. При ее выделении необходимо принять меры предосторожности против ее деградации. Наиболее чувствительным считается полимеразная цепная реакция (P R), а метод гибридизации in situ позволяет уточнить тканевую и клеточную локализацию экспрессии цитокиновых генов. [c.219]

Разработка методов индуцированного слияния протопластов, а также развитие техники культивировании растительных клеток in vitro, обеспечивающей возможность получения изолированных протопластов, их выращивания с образованием каллуса и в последующем целого растения, обеспечила формирование нового весьма перспективного метода гибридизации растений, получившего название соматической гибридизации. Сущность данного приема состоит в том, что в качестве гибридизуемых клеток используют не гаметы (репродукционные клетки), а клетки тела растений (соматические), из которых получаются протопласты. Слияние протопластов обеспечивает объединение не только клеточных геномов, но и двух различных цитоплазм. В большинстве описанных (известных) случаев слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро - одного. [c.102]

Начинается ли репликация ДНК Е.соИ в произвольном месте хромосомы, или же в хромосоме имеется определенный участок инициации Репликация ДНК-строго регулируемый процесс, поэтому а priori кажется гораздо более вероятным, что она начинается в определенном месте. Действительно, как показали работы по определению относительного числа различных генов в условиях быстрого синтеза ДНК, репликация в клетках Е.соИ начинается в одном определенном месте хромосомы. Рассмотрим два гена - д и >. Предположим, что ген д расположен вблизи отточки начала репликации, а ген Ь - вблизи от конца. Тоща ген д будет реплицироваться намного раньше, чем ген Ь. В быстро расту шей культуре на один ген Ь будет приходиться примерно два гена д. Если же, наоборот, репликация ДНК начинается в случайной точке, количество генов д и будет одинаковым. Относительное число генов было определено с помошью метода гибридизации, который рассматривается ниже (разд. 25.5). Результаты этих экспериментов ясно показали, что относительное число генов действительно зависит от их положения на карте (рис. 24.36). Эти данные позволили сделать следующие выводы. [c.29]

Смотреть страницы где упоминается термин Клетки методы гибридизации: [c.230] [c.207] [c.242] [c.233] [c.75] [c.198] [c.208] [c.209] [c.209] [c.116] [c.119] [c.100] [c.92] [c.258] [c.261] [c.198] [c.208] [c.209] [c.209] [c.259] [c.280] [c.207] [c.242] [c.233] [c.75] [c.100] [c.140]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология