Метод метки по сродству

Одна из изящных модификаций метода метки по сродству состоит в получении фотоактивного лиганда. После связывания лиганда с белком лиганд подвергается фотолизу, в результате которого появляется реакционноспособная группа, взаимодействующая с аминокислотными ос-, татками в районе активного центра. В качестве примера такого фотоактивного соединения можно привести 2-[4-(4-азид-3-иод- [c.12]

Действительно, если контролировать солюбилизацию мембранных фосфолипидов детергентами с помощью высокочувствительных методов, можно убедиться, что повышение концентрации детергента экстрагирует из нативной мембраны все имеющиеся там липиды с одинаковой скоростью, не различая прочно связанные (аннулярные) и свободные липиды (рис. 19). Более того, использование спин-меченых фосфолипидов в процессе реконструкции различных мембранных ферментов позволило измерить скорость обмена молекул фосфолипидов между аннулярным слоем и окружающими липидами. Для разных белков обнаруживается своя доля иммобилизованного липида. По вытеснению метки из аннулярного слоя при добавлении немеченого липида можно определить сродство каждого липида к поверхности белка. Характерно, что значения стехиометрии связывания белком пограничных липидов, измеренные этим методом и рассчитанные из геометрических размеров молекулы белка, практически совпадали. [c.43]

Рис. 2. Метод метки по сродству на примере фиксации в активном центре антитела против динитро-фенильной группы специфичного лиганда

Возможности метода метки по сродству для изучения строения и функций клеточных рецепторов весьма велики. Большое разнообразие реакционноспособных (в том числе фотоактивных) соединений позволяет использовать их для получения модифицированных лигандов различного строения и размеров. С их помощью можно получать также реакционноспособные пептиды и белки. В последнем случае необходимо иметь производное с реакционноспособной группой, присоединенной к строго определенному аминокислотному остатку. В качестве примера такого производного можно привести инсулин быка, остаток лизина которого в В-цепи модифицирован Ы-[Ы -(2-нитро-4-азидфенил)-глицином]. Такое производное инсулина нашло применение для маркирования рецепторов гормона на жировых клетках (адипо-циты) (В. С. Reed et al., 1983, 1984). [c.13]

С помощью метода метки по сродству удается оценить вклад в организацию активного центра рецептора боковых аминокислотных остатков полипептидных цепей, образующих его молекулу. Для этого рецепторный белок с ковалентно присоединенным к нему лигандом разделяют на полипептидные цепи и определяют, с какой из цепей связан лиганд (см. разд. 3.1). Каким же образом лиганд, содержащий только одну реакционноспособную группу, может оказаться связанным с аминокислотными остатками двух полипептидных цепей, если обе они участвуют в образовании активного центра Такая возможность существует потому, что при отсутствии стерических ограничений реакционноспособная группировка лиганда способна вступать во взаимодействие с любым подходящим аминокислотным остатком в активном центре, причем вероятность взаимодействия с боковыми остатками соответствующих цепей будет зависеть от их прост-ранс1веи1юго расположения относительно модифицированного лиганда после связывания его в активном центре. [c.15]

Метод метки по сродству получил широкое распространение при изучении активных центров антител. Поскольку антигенсвя-зывающие рецепторы В-лимфоцитов имеют иммуноглобулиновую природу и не отличаются по строению своих активных центров от антител, данные, полученные при изучении последних, приложимы для анализа организации активных центров рецепторов В-лимфоцитов, а также рецепторов другой специфичности. [c.15]

Иная ситуация наблюдается в случае 01-адренергического рецептора, находящегося на мембране клеток печени. Рецептор состоит из трех полипептидных цепей с молекулярными массами 77000, 68000 и 59 000. Если к рецептору ковалентно присоединяют лиганд с помощью метода метки по сродству, последний оказывается фиксированным на каждой из цепей. Взаимодействие рецептора с лигандом (4-амино-6,7-диметоксиквиназолин) специфично и характерно именно для этого типа рецепторов (С. Е. 51ес1тап е а ., 1984). [c.16]

Идентификация аминокислоп ых остатков в активном центре. С этой целью используют метод метки по сродству (см. гл. 1). Препараты рецепторов должны быть высокоочищенными. Лиганды с хорощо изученной структурой модифицируют с таким расчетом, чтобы они образовывали в активном центре рецептора ковалентные связи с боковыми аминокислотными остатками отрезков цепи, формирующих центр. Чаще других используют бромацетильные прс>изводные и фотоактивируемые производные лигандов. Доказательством фиксации лиганда именно в активном центре служит факт необратимого блокирования им центра, препятствующего связыванию немодифицированного меченого лиганда. [c.45]

Третий этап—создание метода метки по сродству с целью идентификации аминокислотных остатков непосредственно в активном центре (L. Wofsy, FI. Metzger, S. Singer, 1962—1964). Сущность метода состоит в том, что гаптен в форме реакционноспособного производного, связываясь с высокой скоростью в активном центре специфичного к нему антитела, обеспечивает взаимодействие реакционноспособнои группы с радикалами непосредственно в активном центре. [c.93]

Рис. 24 схематически иллюстрирует механизм метки по сродству на примере азопроизводного динитрофенильной группы. К настоящему времени синтезировано большое число различных реакционноспособных производных гаптенов, избирательно реагирующих с разными аминокислотными остатками. В ходе реакции образуются устойчивые ковалентные связи, поэтому, разделив полипептидные цепи и фрагментировав их, можно точно локализовать меченый аминокислотный остаток. Таким способом удалось установить, что оба вариабельных домена (от легкой и тяжелой цепей) участвуют своими аминокислотными остатками в формировании полости активного центра и что полость центра выстилают отрезки цепей, соответствующие гипервариабельным участкам. Данные, накопленные с помощью метода метки по сродству , были дополнены результатами, полученными методами дифференциальной спектрофотометрии и электроннопарамагнитного резонанса (см. гл. 12), а также химической модификации определенных аминокислотных остатков в молекуле антитгла. Для ряда гаптенов гидрофобного характера. (например, нитрофениль-ные производные) было доказано присутствие в активном центре антитела остатка триптофана, продемонстрирован гидрофобный характер полости антидетерминанты. Для других гаптенов установлена локализация остатков гистидина, лизина, тирозина и точно определено их местоположение в каждой цепи. [c.93]

Рис. 24. Метод метки по сродству . А — изображение активного центра (ан1иде-терминанты) антитела к динитрофенильной группе и места фиксации азопроизводного динитрофенильной группы на остатке тирозина в активном центре Б — локализация некоторых гаптенов в легкой и тяжелой цепях соответствующих антител при использовании для мечения азопроизводных гаптенов

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т. е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с Ж-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом. После идентификации концевого Ж-амино-кислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток, [c.41]

Идентификация аминокислот, присутствующих в активных центрах ферментов, разумеется, очень важна для понимания главных особенностей механизма ферментативных реакций. Существует ряд методов, с помощью которых можно идентифицировать хотя бы некоторые из аминокислотных остатков, участвующих в построении активного центра. Наиболее прямой метод состоит в присоединении к какому-нибудь аминокислотному остатку, входящему в состав активного центра, ковалентной метки, которая оставалась бы устойчивой в условиях деградации полипептидных цепей. С точки зрения такой возможности все ферменты можно разделить на два класса в один из них входят ферменты, образующие в ходе каталитического процесса ковалентно связанные промегкуточные фермент-субстратные производные, а в другой — ферменты, которые таких производных не образуют. Для ферментов первого класса проблема введения специфической метки в активный центр (а не просто неспецифического введения метки в белок) часто решается путем использования в качестве носителей метки либо обычных субстратов этих ферментов, либо соединений, структурно родственных субстрату. Вследствие специфического сродства этих веществ к активному [c.196]

Один из способов идентификации участков, выполняющих определенную функцию, основан на использовании аффинной метки (метки по сродству). При этом используют аналоги компонентов, которые связываются с рибосомой. Эти соединения либо сами по себе химически активны, либо их можно активировать in situ. Например, можно использовать тРНК с подходящими модификациями таким путем можно идентифицировать рибосомные компоненты, на которые переносится метка. Сходный метод сводится к использованию соединений, способных в результате фотохимического активирования вызывать сшивки, что позволяет идентифицировать взаимодействующие компоненты. [c.112]

Быстрое, и даже бурное развитие протеомики в последние несколько лет определяет интенсивное использование в исследовательской работе рекомбинантных белков. Естественно, работа с индивидуальными белками требует их эффективной очистки. Как всегда, любая задача может быть решена разными способами. Использование для быстрого выделения индивидуальных белков аффинной метки (affinity tag) в виде специфической аминокислотной последовательности, присоединенной к одному из концов исследуемого полипептида, позволяет просто и эффективно решать эту задачу [156]. Присоединение аффинных последовательностей проводят методами генной инженерии, объединяя в составе экспрессируюш,его вектора кодируюш,ую часть исследуемого гена с последовательностью нуклеотидов того или иного пептида или полипептида, обладаюш,его избирательным сродством к лиганду (табл. 5). В целом, системы очистки рекомбинантных белков, основанные на аффинных аминокислотных последовательностях, обладают целым рядом уникальных свойств. Так, они позволяют проводить выделение любого гибридного белка в один этап путем его адсорбции на соответствующем носителе. Сама аффинная метка оказывает минимальное влияние на третичную структуру основного белка и может быть легко удалена из гибридного полипептида. Кроме того, она допускает проведение быстрой и точной количественной оценки содержания белка в искусственных системах экспрессии рекомбинантных генов. Тем не менее использование каждой аффинной метки требует соблюдения конкретных условий, которые не являются универсальными и могут оказывать сильное влияние на биохимические свойства выделяемого белка. [c.124]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология