Мембранные белки солюбилизация

Рис. 6-18. Солюбилизация мембранных белков с помощью детергента. Детергент разрушает липидный бислой, в результате чего белки оказываются в растворе в виде комплексов с молекулами липидов и детергента Фосфолипиды мембран также солюбилизируются с помощью детергента.

ЦИИ трансляции не проходит далее сквозь мембрану, а остается вставленным в мембрану как трансмембранный белок. Можно привести еще ряд аналогичных примеров интегральных мембранных белков, синтезируемых с отщепляемой N-концевой сигнальной последовательностью (гемагглютинин вируса гриппа, тяжелая цепь антигенов гистосовместимости А и В, гликофорин А красных кровяных клеток, цитохром Р-448 и т. д.). Получается, что в синтезе как секреторных, так и интегральных мембранных белков используется один и тот же механизм сигнального пептид-мембранного узнавания, вхождения растущего пептида в мембрану и затем отщепления N-концевого сигнального фрагмента, но терминация трансляции может приводить либо к прохождению конечного продукта сквозь мембрану в случае водорастворимых секреторных белков, либо к его солюбилизации в мембране в случае более гидрофобных белков, предназначенных для внутримембранной локализации. Белки, оставшиеся в мембране. эндоплазматического ретикулума, далее могут подвергаться посттрансляционному транспорту через секреторные пузырьки в мембранные структуры других типов, включая клеточную плазматическую мембрану. [c.281]

СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ [c.315]

Детергенты — это группа амфифильных соединений, которые способны связываться с гидрофобными участками мембранных белков, контактирующими с липидной фазой мембран, тем самым разрушая ее структуру. В ходе солюбилизации мембран детергентами последние модифицируют бислой липидов, разрыхляя его, затем образуют смешанные (белок-липид-детергентные) мицеллы, а в конечном итоге — детергент-белковые и липид-детергентные мицеллы. Для сохранения мембранных белков в растворимом состоянии необходимо постоянное присутствие детергента. Его удаление приводит к агрегации и последующему осаждению молекул белка. [c.224]

Рпс. 3.11. Солюбилизация мембраны неионным детергентом тритоном Х-100. Детергент размещается на гидрофобном участке белка и замещает мембранные липиды. Если концентрация детергента ниже его ККМ, белок сам образует мицеллы или агрегаты, которые часто выпадают в осадок, [c.84]

Биохимические методы позволяют разделять, выделять и анализировать в чистом виде липидные и белковые компоненты, изучать их физико-химические свойства в свободном состоянии и в составе надмолекулярных комплексов в условиях воздействия различных внешних факторов (температуры, концентрации водородных ионов и др.), исследовать их время жизни , пути биосинтеза и распада этих компонентов. К ним относят методы выделения (недеструктивные и включаюп] ие разрушение клеток) разделения субклеточных фрагментов (хроматография, электрофорез, центрифугирование, иммуноаффинные методы) идентификации и оценки чистоты субклеточных фракций выделения органелл и мембранных систем экстракции липидов и разделения их по классам количественного определения фосфолипидов исследования трансмембранного распределения липидов солюбилизации мембранных белков, их реконструкции и определения функциональной активности реконструированных мембран, выделения и модификации мембранных белков. [c.202]

Авторам работы [630] удалось растворить мембранные ферменты в водно-органических растворах при низких температурах, избежав общепринятого метода солюбилизации с помощью детергентов путем образования мицелл в водных растворах. Они удалили липидные компоненты при —75 °С, при этом белок остался в нативном состоянии и сохранил активность. Таким образом, при низких температурах в растворителях, подобных смеси хлороформ—метанол, ферментативная активность не теряется, что открывает большие возможности в изучении мембранных белков. [c.238]

При хроматографии и электрофорезе белков использование органических растворителей исключается из-за их денатурирую щего действия, в результате которого белки переходят в нерастворимое сйстояние. Подобное действие могут оказывать и некоторые органические соединения. Поэтому при разделении белков необходим тщательный выбор селективных водных буферных систем. Однако необходимость солюбилизации белков, в особенности тех из них, которые ассоциированы с биологическими мембранами, привела к введению детергентов — как ионных, так и неионных, а также таких реагентов, как мочевина и гидрохлорид гуанидина, которые разрывают водородные связи и препятствуют гидрофобным взаимодействиям. Даже будучи денатурированными, многие белки остаются растворимыми в присутствии этих соединений, особенно после расщепления ди-сульфидных связей дитиотретиолом или меркаптоэтанолом. [c.105]

Мембранные структуры могут быть подвергнуты солюбилизации. Этот процесс обеспечивается детергентами — группой амфи-фильных соединений, способных связываться с мембранным белком гидрофобными связями, одновременно взаимодействуя полярными группами с водой. В результате молекулы детергента сначала разрыхляют мембрану, при повышении их концентрации образуют смешанные мицеллы, а затем и детергент-белковые комплексы (рис. 35). В ряде случаев при замене липидного окружения на детергент белок сохраняет хотя бы некоторые свои функции. [c.87]

Важным показателем является также агрегационное число детергента количество молекул, входящих в состав одной мицеллы. Из табл. 14 видно, что по этому показателю детергенты группы А сильно отличаются от детергентов группы В первые образуют выраженные мицеллярные структуры, в то время как вторые способны лишь образовывать агрегаты из нескольких молекул. В соответствии с различиями в структуре, определяющими эти свойства, детергенты группы А способны не только внедряться в мембранный бислой, но и солюбилизировать его, образуя собственные мицеллы с встроенными в них мембранными белками. На рис. 35 приведена схема солюбилизации мембран детергентом группы А. Детергенты группы В, не способные образовывать собственные мицеллы, могут лишь встраиваться в мембранный бислой или в мицеллы, образованные детергентами группы А. [c.89]

В последние годы изучение структурных компонентов мембран является одним из основных направлений биохимии. Благодаря высокой разрешающей способности электрофорез (в особенности электрофорез в полиакриламидном геле) служит одним из наиболее важных методов исследования этих компонентов. Так как число мембранных белков очень велико и все они обладают низкой растворимостью в воде, возникает ряд проблем, не встречающихся в других областях биохимии. Поэтому вопросы, связанные с солюбилизацией мембранных белков перед электрофорезом, приобретают большое значение и требуют более подробного рассмотрения. [c.315]

Наиболее широко распространенным детергентом, применяемым для солюбилизации мембран, является ДСН. В концентрации более 1% он переводит в растворимую форму, по-видимому, все мембранные белки бактериальных [613] и эукариотических [358, 755, 829, 896] клеток. При использовании ДСН в более низких концентрациях достигается лишь частичная солюбилизация мембранных компонентов [781], что позволяет фракционировать белки в соответствии с растворимостью их комплексов, образующихся при разных концентрациях ДСН [167]. Присутствие мочевины [766, 776] и обработка ультразвуком [1041] способствуют солюбилизации белков в ДСН. [c.316]

С помощью разнообразных методов фракционирования мембранные белки в солюбилизированной форме могут быть разделены и очи-шены до инднандуального состояния. Последующее удаление детергента в присутствии подходящих фосфолипидов позволяет реконструировать в искусственной мембране ту илн иную функцию изучаемого белка. В таблице 23 приведены структурные формулы н названия детергентов, наиболее часто используемых для солюбилизации и реконструкции мембран. [c.560]

Рис. 2.4. Действие детергента при солюбилизации мембранного белка. В зависимости от соотношения белка и детергента в растворе солюбилизированный белок может находиться в состоянии, показанном на рисунке, или образовывать с детергентом более сложную мицеллу.

Детальному рассмотрению свойств биологических мембран посвящена гл. И. Здесь следует лишь подчеркнуть, что липиды образуют матрицу биологических мембран, а мембранные белки как бы закреплены в ней. Многие мембранные белки практически невозможно перевести в водный раствор без разрушения мембран. С целью солюбилизации мембранных белков широко используются детергенты (сурфактанты), особенно нейтральные, такие, как детергенты ряда тритона-Х. Считается, что детергенты этого типа включаются в состав мембранных бислоев, и после насыщения мембран детергентом образуются смешанные мицеллы, содержащие и детергент, и мембранные липиды, а белки переходят в раствор. [c.92]

Рис. 10.17. Структуры детергентов, используемых для солюбилизации и очистки мембранных белков.

Определена также структура солюбилизированного цитохрома Ьв из микросом печени. Хотя точная функция его неизвестна, можно думать, что он играет роль, подобную роли цитохрома с, взаимодействуя с ферментативной системой эндоплазматического ретикулума, катализирующей образование ненасыщенных жирных кислот. Белок содержит 93 аминокислотных остатка, а еще 44 (преимущественно гидрофобных) отщепляются с Ы-конца в процессе солюбилизации белка. Вероятно эта Ы-концевая часть служит гидрофобным якорем, погружаемым в мембрану эндоплазматического ретикулума. Гем в цитохроме Ьв не связан ковалентно с белком, но прочно удерживается между двумя боковыми цепями гистидинов. По способу свертывания цепи этот белок совершенно не похож ни на цитохром с, ни на миоглобин. И в этом случае не видно путей переноса электрона от атома железа на поверхность молекулы [23]. [c.375]

Поскольку большинство детергентов используется в концентрациях, довольно сильно превосходящих ККМ, и поскольку действие детергентов обусловлено образованием смешанных мицелл с липидами или связыванием с белками, отношения детергент белок или детергент липид значительно важнее истинной концентрации детергента. Как правило, достаточный избыток детергента обеспечивается при соотношении 2—4 мг детергента к 1 мг белка. Например, если для солюбилизации мембран используется 2%-ный тритон Х-100, концентрация белка в пробе должна быть не больше 5—10 мг/мл. [c.154]

Для солюбилизации мембранных белков часто используют неионные детергенты, такие как тритон Х-100, твин-80 и др. Эти детергенты влияют на развитие окраски при определении белка с биуретовым реактивом и методом Лоури. Практически полного удаления детергентов из пробы можно добиться экстракцией их изоамнловым спиртом. [c.82]

Влияние гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) и критической концентрации мицеллообра-зования (ККМ) на солюбилизацию мембранных белков JB 251, 4442 (1976) ВВА 455, 796 (1976) ВВА 553, 40 (1979). [c.234]

В 1971 г. Ф. Сенгер и Г. Николсон предложили жидкостно-мозаичную модель биомембран, согласно которой мембраны представляют собой жидкокристаллические структуры, в которых белки могут быть не только на поверхности мембран, но и пронизывать их насквозь. В этом случае основой мембраны является липидный бислой, в котором углеводородные цепи фосфолипидов находятся в жидкокристаллическом состоянии, и с этим бислоем связаны белки двух типов периферические и интегральнь1е. Первые - гидрофильные, связаны с мембранами водородными и ионными связями и могут быть легко отделены от липидов при промывании буфером, солевым раствором или при центрифугировании. Вторые белки - гидрофобные, находятся внутри мембраны и могут быть выделены только после разрушения липидного слоя детергентом (процесс солюбилизации мембран), например, додецилсульфатом натрия, ЭДТА, тритоном и др. Интегральные белки, как правило, амфипатические, т.е. своей гидрофобной частью они взаимодействуют с жирными кислотами, а гидрофильной частью - с клеточным содержимым. Интегральные белки часто являются гликопротеидами, которые синтезируются в аппарате Гольджи, глико-зилируются в мембране и содержат много гидрофобных АК и до 50% спиральных участков. Эти белки перемещаются внутри липидного бислоя со скоростью, сравнимой с перемещением в среде, имеющей вязкость жидкого масла ( море липидов с плавающими айсбергами белков ). [c.107]

Необходимо упомянуть также еще об одной области, где практическое знание закономерностей образоаания и поведения мииелляр-ных структур имеет прямое отношение к исследованиям биологических мембран. Речь идет о проблемах разборки мембран на составные компоненты с выделением из них отдельных мембранных белков и последующей реконструкции функционально активных комплексов в модельных системах. В настоящее время наиболее предпочтительным подходом к решению этих проблем является использование детергентов. При действии детергентов на выделенные препараты клеточных мембран происходит солюбилизация белков и. 1НПИД0В с образованием смешанных мицелл (рис. 291). [c.560]

Мембранные белки трудно выделить в виде интактных комплексов, так как они нерастворимы в большинстве водных растворов, а такие вещества, как детергенты и мочевина, необходимые для их солюбилизации, могут нарушать нормальное белок-белковое взаимодействие (разд. 6.2.2). Однако в начале 1960-х гг. было обнаружено, что с помощью относгггельно мягких ионных детергентов, таких как дезоксихолат фис. 7-32), можно солюбилизировать некоторые компоненты митохондриальной внутренней мембраны в нативной форме. Это позволило идентифицировать и выделить три главных связанных с мембраной комплекса дыхательных ферментов на пути от NADH до кислорода (рис. 7-33). [c.452]

Дальнейшая работа с мембранными белками - изучение их функций, механизмов действия и пространственных структур, однако, натолкнулась на большие трудности. Оказалось, что высвобождение белковых молекул из мембраны часто сопровождается необратимой денатурацией их нативных структур и, следовательно, потерей активности. В редких благоприятных случаях при солюбилизации белков в мягких условиях и при низких концентрациях функциональные свойства не пропадают, что указывает на сохранение, по крайней мере частичное, нативных конформаций. Наиболее детальная информация о белках и липидном бислое получена при изучении плазматической мембраны эритроцитов человека, содержащих гемоглобин -немембранный белок, представленный в этих клетках в наибольшем количестве [237]. Удобство данного объекта обусловлено тем, что мембраны эритроцитов, называемые "тенями", являются единственными в Клетке и их легко выделить в чистом виде с разрывом и без разрыва и даже получить вывернутыми наизнанку. При изучении теней эритроцитов впервые удалось установить, что некоторые мембранные белки пронизывают насквозь мембранный бислой, а внешняя и внутренняя стороны мембраны являются асимметричными [238]. Исследования белков плазматической мембраны эритроцитов человека [c.57]

Кристаллизация мембранных белков может быть реализована в том случае, когда белок удается очистить до гомогенного состояния без солюбилизации содержащих его мембран в детергентах. Именно к таким белкам относится Ыа" , К+-АТРаза наружного мозгового слоя почек млекопитающих, в частности свиньи. Этот фермент, являющийся натриевым насосом клетки и обеспечивающий создание трансмембранного градиента концентраций ионов натрия и калия, состоит из двух типов субъединиц а и (3, присутствующих в эквимолярных коли- [c.175]

В бислой определенного липидного состава [588, 589]. Широких систематических исследований по двухмерной кристаллизации мембранных белков до настоящего времени не проведено. Поэтому эмпирический подход все еще является основным. Однако результаты, полученные в ходе изучения нескольких мембранных белков, позволяют выделить ряд факторов, влияющих на формирование кристаллов. В общем случае кристаллизация реконструкцией является более многопараме-торным процессом, чем в случае кристаллизации без полной солюбилизации мембран. В зависимости от условий реконструкция белков в липид может приводить к образованию различных структур много- и однослойных протеолипосом, трубчатых структур, плоских мембран. Наиболее удобны для электронно-микроскопического изучения плоские мембраны. Необходимо также, чтобы реконструированный в такие мембраны белок имел "плотную упаковку". Для получения требуемых структур определяющими являются выбор липидов и детергента, концентрация белка и количественное соотношение липид/ белок. Так, при использовании "жидких" липидов варьирование этого соотношения может приводить к появлению всего спектра упомянутых выше структур. Для получения кристаллов обычно приходится проводить изучение влияния на характер упаковки белков в мембранах и таких параметров, как pH, ионная сила, наличие многовалентных ионов. В некоторых случаях необходимо также присутствие специфических лигандов, стабилизирующих белок в одном из конформационных состояний. Существенное влияние могут оказывать также температура и скорость процесса реконструкции, т.е. удаления детергента. [c.181]

Изучение химической природы мембранных белков включает предварительное выделение, солюбилизацию (экстракцию), очистку и анализ очишенных компонентов. Причем применение классических методов сфуктурного анализа для характеристики мембранных белков имеет свои сложности и особенности. Как правило, они обусловлены свойствами мембран и их компонентов, в частности, наличием липидных и гликолипид-ных структур. Проблемы, связанные с экстракцией белковых компонентов мембран, их очисткой и анализом, составляют специальный раздел мембранологии. Здесь будут рассмотрены лишь самые общие моменты. [c.267]

Некоторые мембранные белки растворяются в дистиллированной воде [192, 844] или забуференных растворах [812, 814, 889]. Для частичной солюбилизации мембранных белков была использована их обработка 33%-ным раствором пиридина с последующим диализом против дистиллированной воды [137]. Белковые компоненты базальной мембраны почечных клубочков человека можно избирательно солюбилизировать с помощью хаотропных агентов [825]. Почти все мембранные белки переходят в растворимое состояние в этаноле, содержащем 1% уксусной кислоты [849]. [c.315]

Для изучения иммунологических реакций на молекулярном уровне необходимо создание модельных антигенных систем, в которых молекулы-мишени с известными химическими свойствами взаимодействуют с клетками иммунной системы. В случае антигенов клеточных поверхностей модельная система может включать вместо клеток искусственные носители — липосо-мы. Поскольку мембранные белки обычно нерастворимы в воде, с ними работают только в присутствии детергентов, которые способствуют солюбилизации белков, эффективно заменяя липидное окружение. В связи с тем что детергенты токсичны по отношению к живым клеткам, перед проведением опытов на клетках их необходимо удалять. После удаления детергентов в присутствии липидов могут формироваться искусственные мембраны. Когда мембранные белки включаются в образующиеся таким образом липидные пузырьки, они имитируют клеточные антигены и эффективно стимулируют иммунные реакции. [c.150]

Как правило, для солюбилизации мембранных белков используют различные вещества. Одной из групп таких веществ являются ионные и неионные детергенты, органические растворители и их комбинации. Действие этих веществ приводит к солюбилизации мембранных белков, однако, одновременно с этим, вызывает ту или иную степень их модификации или даже денатурации. Чем больше де-натурационный эффект, тем полнее степень солюбилизации мембранных белков. Растворимость белка можно увели- [c.28]

Не вдаваясь в детальный анализ литературных данных, можно сделать выводы. 1. На искусственных липидных мембранах установлены основные закономерности протекания фузогенного процесса "и изучены факторы, способствующие реализации последнего (табл. 4). 2. Процесс интеграции фрагментов клеточных мембран и мембранных белков с БЛМ характеризуется рядом особенностей и может осуществляться несколькими способами (рис. 33). Особого внимания, на наш взгляд, заслуживают схемы (рис. 33, д, е) реконструкции фрагментов биологических мембран без их предварительной солюбилизации. Таким путем нам удалось реконструировать на БЛМ калий-про-водящую структуру плазматической мембраны неисчерчен-ной мышечной ткани (рис. 34). [c.142]

При дозах детергента 0,3 и 0,5 мг на 1 мг белка митохондрий действие дигитонина исследуют также в присутствии 1 М КС1. В случае адсорбции фермента на внутренней мембране митохондрий под действием КС1 возможна эффективная солюбилизация аспартатаминотрансферазы. Это можно установить, определив активность фермента в супернатанте после центрифугирования обработанной суспензии при 20 000g в течение 20 мин. [c.353]

Л. применяют как эмульгаторы пищ. жиров при синтезе фосфолипидов с заданным сочетанием жирнокислотных остатков. В научных исследованиях Л. используют для солюбилизации нек-рьгх мембранньгх белков, а также как индукторы слияния мембран при получении гибридных клеток. [c.593]

Солюбилизация липидов совпадает с достижением величины ККЛ. Это тот уровень концентрации, при котором начинаются конформа— ционные изменения в мембране и образуются цилиндрические комплексы ДДС - белок после включения всех липидов в мицеллы /ШС. Эти комплексы могут также солюбилизовать холестерин - основной компонент, ответственный за целостность мембран. Выще КК/Ч фос- фолипиды отщепляются от белков мицеллами дезоксихолата, кото- [c.53]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология