Белки определение размеров молекулы

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям. Молекулярная масса их 20 000 и даже 15 000 000 у. е. Они растворяются в воде, образуя коллоидные растворы (вследствие огромных размеров молекул). Белки устойчивы лишь в определенных условиях. При повышении температуры происходит необратимая коагуляция белков, а под действием электролитов — обратимая. Первая характерная для белков реакция ксантопротеиновая—реакция с азотной кислотой. Под действием азотной кислоты белок свертывается, образуя сгусток оранжевого цвета. Вторая характерная реакция на белки — это биуретовая реакция — фиолетовое окрашивание белка при взаимодействии его с гидроксидом меди. [c.371]

Сравнительно недавно разработан метод электрофореза на полиакриламидном геле. Метод характеризуется высокой разрешающей способностью и применяется для фракционирования и определения размеров, конфигурации и суммарного заряда молекул (белков, нуклеиновых кислот и др.) см. обзор 24]. [c.399]

Установлено, что белки могут иметь весьма различные размеры и форму. Определение молекулярной массы и размеров молекул белка выполняется с применением мощного арсенала физических методов исследований. Молекулярные массы можно определить с помощью измерения скоростей диффузии, скоростей седиментации в ультрацентрифуге, рассеяния света и даже путем измерения размеров индивидуальных больших по размеру молекул белка методом электронной микроскопии. [c.510]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Установлено, что белки могут иметь весьма различные размеры и форму. Определение молекулярных масс и размеров белков было выполнено с применением мощного арсенала физических методов исследований. Молекулярные массы можно определить с помощью анализа отдельных компонентов (см. упражнение 20-23), измерения скоростей диффузии, скоростей седиментации в ультрацентрифуге, рассеяния света и даже путем измерения размеров индивидуальных, очень больших по размеру молекул белка методом электронной микроскопии. Сведения о форме молекул получают, измеряя скорости молекулярной релаксации после электрической поляризации, исследуя изменения в оптических свойствах (двойное лучепреломление), возникающие в струе жидкости, непосредственно с помощью электронной микроскопии и, что имеет, быть может, наиболее важное значение, исследуя интенсивность рассеяния света и рентгеновского излучения как функцию угла рассеяния. Применение всех этих методов часто встречает трудности вследствие высокой степени гидратации белков, а также в результате того, что многие белки вступают в обратимые реакции ассоциации, образуя димеры, три-меры и т. д. Молекулярные массы, молекулярные параметры и изоэлектрические точки ряда важных белков приведены в табл. 20-2. [c.125]

Использовать ультрацентрифугу для определения размера коллоидных частиц впервые в 1910 г. предложил А. В. Думанский. Шведский ученый Сведберг широко использовал эту идею, он разработал ряд конструкций ультрацентрифуг для определения размера коллоидных частиц и молекул высокомолекулярных веществ, например белков. [c.77]

Двойное лучепреломление в потоке используют для определения размеров молекул белков, нуклеотидов и вирусов в растворах. В частности, было найдено, что длина молекул сывороточного альбумина 190 A, фибриногена 700 A, 7-глобулина 230 A. В. И. Цветков установил, что метод двойного лучепреломления в потоке позволяет оценить стереорегулярность (соблюдение строгого чередования звеньев) полимерных молекул. Для выяснения структуры белковых молекул и нуклеиновых кислот привлекают данные, получаемые при изучении их оптической активности. [c.204]

Модификацией рентгенографической методики Исследования является определение среднего размера частиц путем рассеяния рентгеновских лучей под малыми углами. Этим методом были получены ценные сведения о размерах молекул белка и о степени их гидратации. [c.50]

Особый интерес представляют приведенные в табл. 1 молекулярные веса, вычисленные для инсулина и гемоглобина. Было найдено, что структурная единица кристалла инсулина имеет молекулярный вес приблизительно 12 ООО. Однако молекулярный вес этого белка в растворе равен приблизительно 36 ООО. В то время, когда проводили рентгеноструктурное исследование инсулина, это несоответствие было непонятным. Определенный в настоящее время химическим путем молекулярный вес инсулина менее 6000. Таким образом, фактически структурной единицей в кристалле является димер. Молекула в растворе представляет собой агрегат из трех таких димеров. В последние годы многие исследователи наблюдали диссоциацию этих агрегатов при подходящих условиях на более мелкие единицы. Подобная ситуация имеет место и в случае гемоглобина. Молекулярный вес гемоглобина в растворе при нейтральном pH равен приблизительно 67 ООО, что находится в соответствии с максимальным молекулярным весом, согласующимся с данными рентгенографии. Однако х-емо-глобин легко диссоциирует на вдвое меньшие по размерам молекулы. [c.76]

Номера в маркировке сефадексов характеризуют их пористость. Выбор определенной марки сефадекса определяется молекулярной массой исследуемого белка (чем больше соответствие размеров молекул и величины пор, тем выше селективность), а степень зернения — поставленной задачей. Для обессоливания растворов белков и их концентри- [c.106]

Белки имеют тенденцию адсорбироваться на различных материалах, это свойство можно использовать для разделения. Целлюлоза, стекло и силикагель — все они нашли применение для адсорбции белков. Классический способ удаления растворенного вещества из раствора — использование измельченного древесного угля, но в случае белков адсорбция затрудняется из-за несоответствия между большим размером молекул белка и малыми порами угля. Древесный уголь модифицируют, покрывая его декстраном и 1 С, и в растворе сохраняется комплекс 1 С-антиген, тогда как антиген адсорбируется на древесном угле. В случае меченого антигена этим способом удаляют из раствора свободную метку, оставляя связанную метку для определения в растворе. [c.577]

За последние годы в связи с возросшей необходимостью анализа и разделения сложных смесей получила значительное развитие ситовая хроматография (гель-проникающая, гель-фильтрационная, молекулярно-ситовая). В качестве подвижной фазы в этом случае используются только жидкости, а неподвижной фазой являются материалы с заданной пористостью, способные избирательно удерживать молекулы веществ с определенными размером и формой. Так, например, в качестве фильтрующих материалов используются сшитые гидрофильные полимеры (гели), обладающие строгой регулярностью пространственной структуры. При пропускании через гель водных растворов белков или других водорастворимых биологических материалов удается удерживать внутри решетки геля молекулы определенного размера, а более крупные молекулы беспрепятственно вымываются подвижной фазой. При этом компоненты смеси элюируются в порядке уменьшения молекулярной массы. [c.46]

Метод применялся главным образом для определения размеров больших молекул, например белков. Обычная процедура состоит в обработке белка флуоресцирующим реагентом, необратимая реакция с которым дает флуоресцирующую полимерную молекулу. Нужные реагенты чаще всего получают, вводя изоцианатные, изотиоцианатные или сульфохлоридные группы в обычные флуоресцирующие соединения. Хорошо взаимодействуют с белком, например, изоцианаты флуоресцеина, родамина Б и антрацена. Флуоресцирующие изоцианаты необратимо реагируют со свободными амино- или сульфгидрильными группами белка. Очевидно, что и реагенты и условия реакции следует подбирать так, чтобы размер и физическое строение молекулы белка изменялись в минимальной степени. Обычно времена жизни полученных этим способом флуоресцирующих конъюгатов белков близки к временам жизни простых флуоресцирующих молекул. Подробные данные о методике и ее применении можно найти в обзоре [308]. [c.373]

Выше представлено описание группы явлений, наблюдаемых при проведении экспериментов по ЯМР-д с растворами диамагнитных белков. Следует подчеркнуть, что полученные результаты отражают влияние растворенного белка и суспендированных клеток на усредненную динамическую предысторию молекул растворителя. Авторы формулируют на основании этих данных точку зрения на гидратацию и взаимодействия растворитель— белок и белок — белок, которые имеют гидродинамическую природу в масштабах, сравнимых с размером белковой молекулы, и кинетическую природу на уровне атомных размеров. Гидратация, в той степени, в которой она отождествляется с особым слоем воды на поверхности белка, относится к молекулам воды с определенной геометрией. Предполагается, что эта геометрия согласована с возможностями образования водородных связей с аминокислотными остатками, выходящими на поверхность макромолекулы, но эти молекулы воды могут быстро обмениваться с объемной водой. Любое замедление движения молекул растворителя обусловлено пространственными затруднениями, возникающими при их диффузии вблизи поверхности молекулы белка, особенно вблизи полярных групп. Шкала времени имеет порядок 10 с. Хотя это время соответствует в 100 раз более медленному движению, чем движение молекул растворителя, оно все же достаточно мало по сравнению с соответствующими временами релаксации во много раз больших по своим размерам молекул белка. Авторы не обнаружили никаких признаков существования особых связывающих центров со значениями времен обмена больше 10 9 с. [c.181]

Раствор, содержащий смесь двух и более веществ, отличающихся по размеру молекул, а следовательно, и по молекулярной массе, вносят в колонку, заполненную гелем с сетчатой структурой и уравновешенную буферным раствором. Наибольшей скоростью продвижения по колонке обладают компоненты раствора, размеры молекул которых больше пор геля. Такие компоненты не проникают в гранулы гелевой фазы и выходят из колонки первыми. Более мелкие молекулы, способные проникать внутрь геля, непрерывно обмениваются между жидкими фазами внутри и вне геля и продвигаются по колонке значительно медленнее. Находящиеся в растворе самые маленькие частицы (например, неорганические соли) выходят из колонки последними. На этом принципе основаны методы фракционирования белков и других полимеров, их обессо-ливание, определение молекулярной массы, замена одних буферных растворов другими и др. [c.106]

Ввиду того что явление интерференции света, рассеянного большими частицами, дает мощный метод определения их формы и размеров, было бы желательно распространить этот метод для исследования частиц меньших размеров, используя излучение с более короткими волнами. Например, используя излучение с длиной волны приблизительно 100 А, можно было бы получить такого рода сведения для белков с глобулярными молекулами малых размеров, тогда как рассеяние излучения с длинами волн, соответствующими излучению ртут- [c.363]

Размеры молекул белков, определенные по характеристическим вязкостям [c.452]

Растворы белков обладают многими свойствами, которые характерны для лиофильных коллоидных растворов. Молекулы белков не проходят через полупроницаемые мембраны, и это используется для их очистки от низкомолекулярных примесей при помощи диализа. Представляет большой интерес определение размеров, формы белковых молекул и молекулярных весов белков. Для этой цели используется целый ряд физико-химических методов. Так, белки в растворах седиментируют в ультрацентрифугах при ускорениях до 200 ООО g , величины констант седиментации колеблются от 1 Ю до 90—100 сек. Коэффициенты диффузии — в пределах от 0,1 10 до 10- 10 средний удельный объем — около 0,75 см г. Размеры и форму (асимметрию) частиц белка определяют, кроме того, методами светорассеяния, двойного лучепреломления в потоке, измерениями вязкости, коэффициента вращательной диффузии, но, по-видимому, наиболее точно — прямым наблюдением в электронном микроскопе в тех случаях, когда молекулы белка достаточно велики и когда удается преодолеть технические затруднения. Молекулярные веса, кроме названных выше способов, определяют методами осмометрии, гель-фильтрации, исследованием монослоев белков на поверхности жидкой фазы, светорассеяния и др. [c.30]

Интересный метод определения коэффициента вращательной диффузии 0 и размеров молекул по поляризации флуоресценции разработан Вебером. Он получал химические соединения белков с [c.61]

В продаже имеется значительный выбор матриксов различных типов (рис. 4-46). Ионообменные колонки набиты маленькими шариками, заряженными положительно или отрицательно. При использовании гаких колонок фракционирование белков происходит в соответствии с расположением зарядов на поверхности белковых молекул. Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи в таких колонках задерживаются белки с обнаженными гидрофобными участками. Колонки, предназначенные для гелъ-филътрации заполнены крошечными пористыми шариками при использовании таких колонок происходит разделение белков по размерам Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми. Г ель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров. [c.212]

Белок, молекулы которого превышают размер пор, будет свободно проходить между гранулами и выходить первым из хроматографической колонки (рнс. 68). Вещества с меньшим молекулярным весом будут распределяться во внутреннем объеме гранул и растворителе, протекающем между ними, отставая при этом в движении. Путь, пройденный белком при определенных условиях, зависит от размеров молекулы, что позволяет использовать гель-хроматографпю (обычно в тонком слпе) для определения молекулярного веса по калибровочным кривым (рнс. 69). [c.172]

Такая методика исследования применялась для определения молекулярной массы белков и нуклеиновых кислот и для изучения их строения в адсорбционном слое этот метод позволяет получить ценные сведения о конформации молекул в поверхностном слое, поскольку эта последняя олределяет величину площади, занимаемую ими в двухмерной пленке. Чтобы преодолеть вазимное шритяжение молекул в адсорбционном слое, эти измерения проводят в той области значений pH, в которой молекулы заряжены вследствие ионизации. Электростатическое отталкивание несколько увеличивает эффективный размер молекул, но это влияние, как правило, невелико, и им пренебрегают. Более существенно заряд молекулы влияет на конформацию молекулы белка и площадь, занимаемую ею на поверхности. Соответственно конформация белка зависит от pH среды, так как величина pH определяет диссоциацию ионогенных групп и их гидратацию. При изменении pH изменяется и наклон прямых л5м(л) (см. рис. II—19), т. е. величина 51. [c.66]

По данным Измайловой с сотр., значительной способностью к солюбилизации углеводородов обладают молекулы некоторых белков и ферментов, причем солюбилизированные молекулы способны в(праиваться в определенные участки этих макромолекул. Исследование солюбилизации, в частности солюбилизации углеводородов в водных растворах белков, позволяет сделать определенные выводы о строении этих молекул в растворе [10]. Так, изучение зависимости солюбилизации от размеров молекул углеводорода позволяет определить размер и количество гидрофобных областей в молекулах белка. [c.283]

Для обессоливанпя и рассортировки молекул скорость элюции может быть выбрана довольно большой — порядка 20 мл/см- ч (следует предварительно проверить сжимаемость геля ). Как было показано в гл. 1, с позиций достижения наилучшего разрешения пиков существует оптидгальная скорость хро.матографического фракционирования. Слишком медленная элюция приводит к резкому уширению пиков за счет продольной диффузии, слишком быстрая — к более ностененному их уширению за счет нарушения равновесия поперечной диффузии. Оптимальная скорость зависит от размеров молекул и гранул, увеличиваясь с уменьшением тех и других. Для ориентировки можно указать, что оптимальная скорость элюции для белков составляет примерно 2 мл/см -ч (для определения объемной скорости элюции это значение надо умножить на илощадь сечения колонки). Однако нередко имеет смысл в интересах оптимизации условий эксперимента в целом значительно отступить от оптимальной скорости элюции в сторону ее увеличения. [c.136]

Интересный метод определения коэффициента вращательной диффузии в и размеров молекул по поляризации флуоресценции разработан Вебером. Он получал химические соединения белков с флуоресцирующими красителями (например, с /-диметиламинонафталин-5-сульфонил-хлоридом) и измерял интенсивность флуоресценции по различным направлениям. Было показано, что степень поляризации флуоресценции наибольшая при малых 0, тогда как при больших 0 флуоресценция полностью деполяризована. Промежуточные значения степени поляризации флуоресценции отвечают определенным значениям 0, откуда по формуле (HI. 9), или по (П. 5.) вычисляются размеры молекул. Вебер исследовал этим методом размеры ряда белковых молекул и процессы их денатурации Гейнц применил этот метод к растворам полистиролов Валь — к растворам поливиниламинов и др. [c.67]

Электрофорез проводят в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Таким путем можно определить молекулярные массы субъединиц олигомерных белков [74 — 76]. Молекулы ДСН образуют за счет гидрофобного взаимодействия комплексы с полипептндными цепями, характеризующиеся постоянным отношением ДСН белок. Тогда электрофоретическую поднижность можно выразить как функцию молекулярной массы и сравнить с подвижностью стандартного белка. Метод отличается высоко скоростью (2 — 4 ч) и требует для одного определения, как правило, лишь 10 — 50 мкг белка. В последнее время ДСН-электрофорез проводят также на стеклянных шариках с контролируемым размером пор (120 — 200 нм). Комплекс ДСН — белок не адсорбируется на носителе, интервал определяемых молекулярных масс 3 500 — 12 ООО [77]. [c.362]

По методу Бредига, пользовавшегося разбавлениоп соляной кислотой, заряжаются отрицательно за счет ионов хлора, адсорбированных из раствора. С другой стороны, кислые, основные или амфотерные вещества, будучи в коллоидном растворе, приобретают заряд обычно за счет собственной ионизации. Так, амфотерные белки (стр. 170) в кислой среде образуют положительно заряженные частицы, в то время как в щелочной частицы несут отрицательный заряд. Подобные вещества являются коллоидными электролитами, один из иоиов которых имеет размеры коллоидной частицы. Каков бы ни был источник зарядов, коллоидная частичка окружается в растворе слоем ионов противоположного знака, образуя таким образом вместе с собственными ионами так называемый двойной слой. Гельмгольц представлял себе двойной слой состояпщм из противоположно заряженных слоев, находящихся друг от друга на определенном расстоянии порядка размеров молекулы. Таким образом, в двойном слое должно иметь место очень резкое падение потенциала. Эта разность потенциалов называется -потенциал. Тепловое движение делает наличие такого местного двойного слоя мало вероятным. Внешние ионы образуют диффузный слой, концентрация которого постепенно уменьшается, доходя до среднего значения в основной массе раствора. Размещение ионов подчиняется закону распределения, подобно изображенному на рис. 1 (стр. 12), так что двойной слой не обладает определенностью гельмгольцевского, напоминая скорое рис. 5 (стр. 130), нежели рис. 2, а этой главы. [c.212]

Применение вычислительных методов длительное время также не давало существенно лучших результатов даже и после установления того фундаментального факта, что процессы формирования белков являются обратимыми. Постулат о том, что собственно последовательность аминокислот в белке лежит в основе определения его пространственной структуры, а результирующая конформация белка в целом должна соответствовать минимуму свободной потенциальной энергии, не облегчил в заметной мере вычислительную задачу. Неизмеримые трудности состоят в том, что вследствие огромных размеров молекул белков имеется астрономически большое число их возможных конформаций. Поэтому потребовались бы многие годы компьютерного времени, чтобы сравнить их энергии. Решение вычислительной задачи стало возможным с разработкой программы LINUS. Эта программа основана на гипотезе иерархической конденсации . Согласно этой гипотезе, соседние участки цепи белка взаимодействуют во время ее складывания и образуют локальные фрагменты, которые затем ассоциируют в более крупные структуры. Процесс продолжается в иттерационном режиме до формирования конечной третичной структуры. Фундаментальное отличие программы LINUS от предшествующих программ заключается в том, что, согласно гипотезе иерархической конденсации , сложенный белок необязательно достигает состояния глобального минимума энергии (самое низкое из возможных состояний энергии), а оказывается в состоянии локального минимума (самое низкое из достижимых состояний энергии). Применение указанной программы позволяет объективно предсказывать и вторичную, и третичную структуру белка. [c.532]

Разновидность хроматографического метода, в котором роль неподвижной фазы играет макропористый сорбент, адсорбционно инертный по отношению к молекулам хроматографируемого веш,е-ства, называется гель-проникаюш ей хроматографией, если размеры пор соизмеримы с размерами молекул. Название метода сложилось исторически и недостаточно полно отражает его сущность. Это объясняется тем, что на первых порах (60-е годы) в качестве сорбента использовали только набухающие гели — декстрановые для разделения белков и нолистирольные для анализа полимеров [1, 2]. Они представляют собой трехмерные полимерные сетчатые структуры (рис. HI.1), внутрь которых могут с определенной вероятностью проникать различные макромолекулы. Эта вероятность зависит от соотношения размеров макромолекул и ячеек сетки, а скорость проникновения в гель определяется диффузионной подвижностью макромолекул. Для малых макромолекул она выше, чем для больших. Очень большие молекулы не проникают внутрь геля, а очень малые попадают туда с вероятностью, близкой к единице. [c.81]

Белки являются наиболее важным комйонентом живой материи. В отличие от других высокомолекулярных соединений, входящих в состав живых организмов, белки широко различаются по размерам молекул, заряду, растворимости в воде и других полярных растворителях и даже по содержанию в тканях. Сочетание свойств, характеризующих отдельный белок, в конечном счете определяется специфической аминокислотной последовательностью полипептидной цепи (или нескольких цепей, если речь идет о многоцепочечном или субъединичном белке). Огромное разнообразие белков служит причиной образования сложных смесей, различных по составу, но близких по физико-химическим свойствам. Основными факторами позволяющими фракционировать белки на колонках с различными материалами, является их амфотерный характер и большие вариации в размерах молекул. На способности белков связывать специфические лиганды основан эффективный метод избирательного выделения — аффинная хроматография. С другой стороны, в исходном материале всегда присутствуют протеазы и пептидазы, что накладывает на условия выделения определенные ограничения, например в отношении температуры, диапазона pH и т. д. [c.421]

Прямые физические методы. Самым старым и самым прямым методом исследования биополимеров следует считать, по-видимому, электронномикроскопический метод. Недавно Клейншмидт обнару кил, что если препарат нуклеиновой кислоты, непосредственно выделенный из живого организма методом осмотического шока или взятый после предварительного выделения, комплексировать с каким-нибудь основным белком, например с цитохромом с, то его mohiho нанести на поверхность воды в виде моно-молекулярной пленки. На фиг. 51 приведена электронная микрофотография фаговой ДНК, полученная Томасом и Мак-Хатти при помощи этого метода. Снимок позволяет оценить размеры молекулы ДНК и ясно показывает, что эта молекула замкнута в кольцо. Определенная таким способом длина молекулы, равно как и ее диаметр, соответствуют величинам, которых следует ожидать на основе гипотезы Уотсона — Крика. Показано, что молекулы ДНК из многих источников имеют форму кольца или замкнутой петли. У ДНК фагов Я и Т2 переход от линейной формы к кольцевой осуществляется легко и обратимо. [c.143]

Детальный механизм, предложенный здесь, дает возможный ответ на вопросы, поднятые в начале этого раздела. Почему макромолекулы белка могут сами по себе действовать как ферменты Почему они так специфичны в выборе вещества, на которое они действуют Согласно описанному механизму, можно предположить, что участок фермента должен обладать весьма жесткой пространственной конформацией. Жесткая структура, следовательно, необходима как каркас, на котором расположены различные части активного участка. Из всех макромолекул, с которыми мы встречались в этой книге, одни белки способны выполнять такую роль. Их специфичность тоже объясняется строго определенными размерами активного участка. Пространственная конфигурация активного центра, точно заданная для реакций с ионами фумаровой или (—)-яблочной кислоты, очевидно, не подойдет для других молекул, которые могут напоминать ионы фумаровой кислоты или (—)-яблочной кислоты химически, но будут отличаться от них пространственной структурой. [c.738]