Биосинтез в бесклеточных системах

Большинство работ по изучению биосинтеза природных соединений проводилось на целых растениях и интактных микробных клетках. Такой подход обычно применим для ряда простых предшественников, которые легко преодолевают барьер клеточных стенок однако иногда, особенно в случае сложных предшественников, например олигопептидов, проницаемость клеточных мембран может стать серьезным ограничением. Даже если этот фактор ие стал лимитирующим, сложные промежуточные соединения внутри клетки могут подвергаться действию других ферментов, помимо ферментов, участвующих в исследуемом биосинтетическом пути. В этой связи понятно, что дальнейший прогресс в изучении биосинтеза невозможен без привлечения специальных биохимических методов, в особенности техники работы в бесклеточных системах и с фракционированными ферментами. В последние годы в этом направлении наметились определенные сдвиги [15]. [c.349]

При анализе меченых пиримидиновых колец выяснилось, что N-3 возникает из аммиака, С-2 — из СОг, а С-4, С-5 и N-1 — из аспарагиновой кислоты. В опытах с возможными предшественниками пиримидина, содержащими изотопы, было установлено также, что путь биосинтеза пиримидинов проходит через уреидо-янтарную (карбамоил-аспарагиновая) и оротовую (урацил-6-кар-боновая) кислоты [15, 49—51]. Этот механизм был детально изучен на бесклеточных системах, выделенных из печени или из бактерий. [c.178]

Биосинтез в бесклеточных системах [c.247]

Описаны многочисленные случаи обнаружения в клетках фракций РНК, которые отличаются высокой скоростью биосинтеза и более или менее близки по нуклеотидному составу к ДНК соответствующих клеток. Эти фракции способны вызывать включение радиоактивных аминокислот в белок в присутствии бесклеточной системы биосинтеза белка. На основании совокупности этих данных считается возможным рассматривать их как информационные РНК. [c.40]

Эта общая схема биосинтеза белка обоснована данными, полученными при изучении включения аминокислот в белок в бесклеточных препаратах. Большинство работ было выполнено на препаратах из печени крысы [62] и микроорганизмах [48], однако бесклеточные системы, способные включать аминокислоты в белок, можно также получить из высших растений. [c.194]

Замена дезоксирибозы на рибозу или тимина на урацил не дает оснований считать, что конформации РНК и ДНК в растворе должны существенно различаться между собой. Однако поведение этих веществ в растворе в действительности оказывается различным, что может быть объяснено так же, как объясняется образование этих двух полимеров в живом организме. Цепи двойной спирали ДНК разделены, и каждая из них служит матрицей, определяющей последовательность остатков оснований во вновь образованной цени, которая должна удовлетворять правильному расположению А — Т и Г — Ц (рис. 42). Этот процесс, в котором создается равное число комплементарных, дополняющих друг друга цепей с последовательностью мономерных звеньев, идентичной последовательности исходной макромолекулы, может быть продемонстрирован на примере бесклеточной системы, как это и было показано изящными экспериментами в лаборатории Корнберга [356, 357]. При биосинтезе РНК последовательность мономеров также определяется [c.129]

Приготовление смеси компонентов для бесклеточной системы биосинтеза белка [c.356]

При изучении биосинтеза коллагена в. бесклеточной системе из куриных эмбрионов нами было показано, что выделенный из системы с помощью этой обработки радиоактивный материал расщепляется высокоочищенной коллагеназой и может служить субстратом для коллагеновой пролин-гидроксилазы. Это доказывает, что применяемая обработка позволяет выделять синтезированные в системе индивидуальные белки. [c.357]

Из-за высокой стоимости очищенных компонентов в подавляющем большинстве случаев бесклеточные системы биосинтеза белка используют в аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. Однако в последнее время разработаны проточные белоксинтезирующие системы, в которых процесс трансляции удается поддерживать длительное время, непрерывно подводя извне расходуемые вещества, с одновременным удалением синтезируемых белков и продуктов деградации компонентов системы. Основные принципы получения и функционирования всех разновидностей белоксинтезирующих систем будут рассмотрены ниже. [c.186]

Одним из наиболее важных условий функционирования бесклеточных систем биосинтеза белка является нативное состояние рибосом и факторов трансляции. В качестве источников этих компонентов в бактериальных бесклеточных системах чаще все- [c.186]

Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в присутствии ионов К или NH4, оптимальные концентрации [c.188]

Бесклеточные системы биосинтеза белка позволили генной инженерии получать экспрессию изолированных генов, не прибегая к помощи живых клеток. До недавнего времени все обсуждавшиеся выше бесклеточные системы существовали только в [c.190]

Исследование влияния 3,4-дегидропролина на биосинтез белка в бесклеточной системе из Е. соИ В. показало, что при концентрации Ь-3,4-дегидропролина 0,05 мкмоль/мл наблюдается торможение включения С -пролина в белок на 83%, а при концентрации ингибитора (его L-формы) 0,5 мкмоль/мл имеет место полное предотвращение включения С -пролина в белок [5]. Предполагается, что 3,4-дегидропролин, будучи конкурентным ингибитором пролил-т.РНК-синтетазы, связывается с активным центром и, тем самым снижает эффективную концентр ацию фермента. [c.133]

Диапазон применения этой формы направленного биосинтеза существенно варьирует и зависит как от пептида, так и ог организма. Тем не менее этот путь открывает интересный метод получения новых антибиотиков определенной серии метод можно использовать и в бесклеточной системе см. схему (3) . Предполагаемый путь биосинтеза феноксазонового ядра актиномицинов показан на схеме (7) [41—43] (см. также разд. 30.3.5). [c.325]

Интересно сравнить биосинтез соединения (6) и альтернариола [лактона кислоты (18)]. Биосинтез альтернариола осуществляется комплексной синтетазой, которая изучалась и в бесклеточной системе [20]. В этом случае стадия ацилирования должна включать последовательное ацилирование малонильных групп ацильными звеньями от С2 до Си. Здесь нет стадий восстановления и очевидна необходимость предотвращения преждевременной циклизации. Подобным же образом при синтезе соединения (20)—предшественника тетрациклина (см. разд. 29.1.3.6) по меньшей мере первые семь звеньев вероятного промежуточного соединения (19) (выделенные в формуле рамкой) должны быть собраны в единую структуру (19) (или в ее енолизированную форму) прежде, чем произойдет хотя бы одна циклизация. На этом же примере можно видеть, как влияет одна стадия восстановления — дегидрирования на весь процесс биосинтеза г ис-конфигурация двойной связи в (19) поворачивает растущую молекулу и таким образом помогает закрепить определенное пространственное расположение цепи, необходимое для специфической циклизации. [c.422]

Абсцизовая кислота (109) является широко распространенным регулятором роста растений важное биологическое значение этой кислоты обусловило интенсивное исследование путей ее биосинтеза [78]. Для этого была использована бесклеточная система из плодов авокадо. Хотя абсцизовую кислоту можно рассматривать как продукт деградации каротиноидов, однако при введении [ С] фитоина в эту бесклеточную систему радиоактивная метка включается только в каротиноиды, но не в абсцизовую кислоту. В то же время абсцизовая кислота приобретает три метки из [2- С] мевалоната. Концевая г<ис-двойная связь метится изотопами водорода из 4-рло-(i )-мевалоната и, следовательно, образуется на какой-то стадии из транс-двойной связи. Опыты с мевалонатом, стереоспецифически меченным при С-2 и С-5, показали, что при образовании двойной связи наблюдается только транс-элиминирование от атомов С-4 и С-5 предшественника абсцизовой кислоты с потерей 2-p/ o-(S)- и 5-рло-(7 )-водородных атомов мевалоната. Гидроксиэпоксид (-)-)-2-г<ггс-ксантоксиновая кислота (ПО) является предшественником 7-гидрокси-а,р-ненасыщенного кетона— абсцизовой кислоты. 2-рло-(S)-Водородный атом мевалоната при образовании двойной связи теряется от С-З -атома, а 4-pro- R)-водородный атом мевалоната — от С-Г-атома при введении кислородной функции. Метильные группы метятся, как показано в фор- [c.513]

В доступных в настоящее время бесклеточных системах биосинтез останавливается иа стадии кобириновой кислоты. [c.672]

Общий механизм синтеза ДНК. Основываясь на данных о двухспиральной антипараллельной структуре, химическом составе ДНК (см. главу 3) и значении активированной формы энергии для биосинтеза полимерных молекул, А. Корнберг еще в 1955 г. указал на возможность синтеза ДНК энзиматическим путем в бесклеточной системе в присутствии изолированной из Е. соИ ДНК-полимеразы и предшественников дезоксирибонук-леозидтрифосфатов. Реакция, практически осуществленная в 1967 г., сводится к синтезу новой молекулы ДНК [c.481]

Эта регуляция реализуется, по-нидимому, на всех стадиях биосинтеза белка. Регулируется работа полимераз, аминоацил-тРНК-синтетазы и рибосом. Установлено, что антибиотики влияют на трансляцию кода, воздействуя на рибосомы. Стрептомицин, нарушающий трансляцию и в бесклеточной системе, внедряется в 30 S-субъединицы рибосом. [c.289]

Примером такого рода реакций может служить процесс биосинтеза целлюлозы, происходящий в бесклеточной системе из A etoba ter хуИ-nium предшественниками целлюлозы являются уоидиндифосфатглюко-за и целлодекстрины [c.610]

Крупные успехи в понимании биохимических аспектов синтеза белка были достигнуты главным образом благодаря тому, что исследователи научились воспроизводить большинство наиболее важных этапов этого процесса в бесклеточных системах использование различных методов, основанных на применении бесклеточных систем, является одной из наиболее характерных черт современной биохимии. Первая бесклеточная система, предложенная в 1952 г. Сикевицем (работавшим тогда в лаборатории Замечника в Гарвардском университете), содержала микросомную фракцию печени крыс. В последующие три года в лаборатории Замечника и одновременно в нескольких других лабораториях были сделаны важные открытия. Было показано, во-первых, что в микросомной фракции за синтез белка ответственны рибосомы во-вторых, что аминокислоты, принимающие участие в биосинтезе белка, активируются АТФ в реакции, катализируемой специфическими активирующими ферментами аминоацилсинтетазами или ацилазами), которая приводит к образованию неорганического пирофосфата, [c.519]

Общепринятая схема биосинтеза белка требует присутствия в цитоплазме живой клетки особого вида РНК, нуклеотидная последовательность которой определяет аминокислотную последовательность синтезируемого белка. Справедливость этой схемы была подтверждена получением в бесклеточной системе белкового синтеза полипептидов определенной аминокислотной последовательности в присутствии синтетических полинуклеотидов (см. стр. 83) и специфических вирусных белков в присутствии РНК вирусов. Однако до сих пор из нормальной клетки не удалось получить в индивидуальном состоянии РНК, которая была бы способна вызывать синтез определенного белка при взаимодействии с рибосомами и аминоацил-тРНК. [c.40]

Изучалось также влияние частичного дезаминирования полинуклеотидов на способность тРНК вступать в биохимические реакции а также на способность синтетических полинуклеотидов служить матрицей для ДНК-полимеразы или функционировать в бесклеточной системе биосинтеза белка Азотистая кислота является эффективным мутагеном. По современным представлениям (обзор — см. з), этот мутагенный эффект связан с дезаминированием остатков аденина и цитозина, так как продукты таких реакций — гипоксантин и урацил — способны образовывать комплементарные пары с цитозином и аденином. Дезаминирование же остатка гуанина приводит в основном к инактивации генетического материала. [c.421]

Постепенно научились составлять искусственные системы, в которых идет биосинтез белка. На этих бесклеточных системах удалось выяснить, какие компоненты клетки необходимы для протекания процесса, а также роль каждого из компонентов. В состав бесклеточной системы входит набор всех аминокислот, АТФ (рррА) или синтезирующая АТФ система, ионы Мд , фракция клеточных рибосом, рН5-фракция надосадочной клеточной жидкости, содержащая соответствующие ферменты (Е), и набор [c.482]

Для изучения механизмов, трансляции в процессе белкового синтеза, а также различных факторов, влияющих на этот процесс, широкое распространение получили бесклеточные системы биосинтеза белков. Ниже описан метод изучения синтеза коллагена и других белков в бесклеточной микросомной системе из куриных эмбрионов, который может быть использован также для исследования биосинтеза белкой, образующихся в других тканях животных. Метод представляет собой модификацию ранее описанных методов (Hoagland е. а., 1958 Sauer, Burrow, 1972). [c.353]

Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы [260]. Любая бесклеточная система создается, прежде всего, для моделирования конкретных биохимических процессов, происходящих в живом организме, и во время функционирования воспроизводит некоторые существенные особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы часто используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, а также на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам. [c.185]

Такое простое усовершенствование бесклеточной системы сильно изменило характер ее функционирования. Биосинтез белка в ней может продолжаться непрерывно в течение нескольких десятков часов, причем на одну молекулу транслируемой мРНК синтезируются сотни копий полипептидных цепей белков, суммарный выход которых может достигать 200 мкг и более на 1 мл бесклеточного экстракта. [c.191]

Еще один важнейший аспект получения белков для практических целей был обозначен акад. А. С. Спириным в докладе на юбилейной сессии Академии наук СССР (март 1987 г.). Он сводится к преодолению клеточного уровня биосинтеза белков и переходу к масштабированному их синтезу в бесклеточных системах трансляции непрерывного действия, работающих в проточном режиме. Это откроет возможность получать биологически значимые белки (интерферон, инсулин, ах-антитрипсин) и пептиды медицинского назначения, позволит конструировать и производить белки с любыми заданными свойствами, поднимет на новый уровень изучение закономерностей химической коэволюции белков и нуклеиновых кислот. Решающую роль здесь играет наработка необходимых количеств соответствующих мРНК в системах, содержащих РНК-зависимую РНК-полимеразу типа репликазы фага Qp. Уже создана и опробована на РНК-4 вируса мозаики костра, РНК фага М82 и мРНК кальцитонина установка для твердофазной трансляции типа реактора непрерывного действия. Указанные работы по внеклеточному синтезу белка ведутся в рамках Государственной научно-технической программы Новейшие методы биоинженерии . Уже сегодня в лабораторных условиях на небольших биореакторах этим методом можно получать достаточное для дальнейших исследований количество пептидных гормонов, антигенов для диагностических целей, белковых токсинов и антитоксинов, антивирусных защитных белков, некоторых ферментов. Революция в молекулярной биологии и биотехнологии продолжается. [c.305]

За последнюю четверть столетия наше понимание биосинтетического происхождения природных соединений значительно продвинулось вперед в некоторых областях, например в химии стероидов, тетрациклинов и индольных алкалоидов, достигнуты поразительные успехи. Пути биосинтеза соединений других групп изучены недостаточно. Например, мы до сих пор еще очень мало знаем о деталях механизма циклизации трипептидного предшественника в бициклическую кольцевую систему пенициллина. Надежды на то, что и в этой области в ближайшем будущем будет достигнут прогресс, связаны с некоторыми последними достижениями, в том числе с выяснением стереохимии включения прохи-ральных 3-углеродных атомов цистеина [110,111] и валина [112,113], а также с применением методов работы с протопластами и бесклеточными ферментными системами [114,116]. Путем выделения и изучения соответствующих ферментов или ферментных систем удалось добиться определенных успехов и в выяснении биогенеза других классов вторичных метаболитов [115]. [c.390]

В 1957 г. Клейн [21], работая с бесклеточными ферментными системами из дрожжей, впервые отметил заметное стимулирующее действие СОз на биосинтез липидов. Годом позже Джибсон и сотр. [8] достоверно показали, что присоединение СОз к ацетил-КоА с образованием малонил-КоА катализирует особый фермент — ацетил-КоА-карбоксилаза и что при [c.189]

Ньюком и Штумпф [28] провели серию опытов, в которых они инкубировали срезы семядолей созревающих и прорастающих семян арахиса с различными радиоактивными субстратами. В обоих случаях при включении метки в высокомолекулярные жирные кислоты наиболее эффективным из всех испытанных соединений оказался ацетат. К 1964 г. из тканей высших растений было получено по крайней мере пять бесклеточных препаратов, легко осуществляющих биосинтез жирных кислот с длинной цепью. Ниже мы рассмотрим эти системы. [c.190]

Направление считывания мРНК — считывание генетического текста в процессе биосинтеза полипептидной цепи белка, начиная с 5 -конца полинуклеотидной цепи и кончая З -концом. Например, если в качестве матричной РНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе используется гексануклеотид, А—А—А—У—У—У, то ос-новнмм продуктом реакции является дипептид Лиз—Фе. А когда в качестве мРНК используются полинуклеотиды со структурой А—А—А......А—А—Ц, то среди продуктов обнаруживаются олигопептиды со структурой Лиз—Лиз—Лиз.....Лиз—Асп [c.61]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология