Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

Рис. 1.11. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

С помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) можно определить размеры и субъединичный состав белков [27] [c.215]

Определение белкового состава. В большинстве случаев выделяемые мембранные фракции содержат большой набор белков с различной молекулярной массой. Тем не менее определение белкового состава с использованием электрофореза в полиакриламидном геле (в присутствии додецилсульфата натрия) может оказать- [c.66]

Для построения калибровочной кривой при определении молекулярных масс используют белки-стандарты тропонин С (18 000 Да), тропонин I (24 000 Да), тропонин Т (38 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да) и бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), а также стандартный набор для определения молекулярной массы белков. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат миозина дает расположенную почти у старта интенсивную полосу тяжелых цепей с м. м. ок. 20 ООО Да и три слабые, но отчетливые полоски легких цепей с м. м. ок. 20 ООО Да для самой тяжелой из них и около 16 000 Да — для самой легкой. Подвижность этих полос в описанных выше условиях высока, поэтому при достаточно большой продолжительности электрофореза эти полоски могут обнаружиться почти у фронта красителя (бромфенолового синего). [c.397]

Сукцинат убихинон-редуктаза (СУР) катализирует окисление сукцината убихиноном. По данным электрофореза, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия фермент состоит из 3 —4 полипептидов. Субъединицы с молекулярными массами 70 000 и 28 000 Да представляют собой собственно сукцинатдегидрогеназу, в субстратсвязывающем центре которой происходит дегидрирование сукцината низкомолекулярные компоненты комплекса И (м. м. ок. 15 000 Да) придают сукцинатдегидрогеназе реактивность по отношению к убихинону, чувствительность к специфическим ингибиторам и, по-видимому, принимают участие в связывании фермента с мембраной. Выделение препарата СУР основано на экстракции фермента из мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и концентрировании препарата охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование сульфатом аммония и очистка на кальдий-фосфатном геле позволяют получить фермент в высокоочищенном состоянии с каталитической активностью около 25 мкмоль окисленного сукцината в 1 мин на [c.423]

Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю. Самый простой спектрофотометрический способ заключается в регистрации изменения поглощения раствора конъюгата при определенной длине волны по сравнению с исходным белком-носителем. Можно также рассчитать соотношение компонентов конъюгата из данных по молекулярной массе, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата. Если конъюгат получили путем пришивки гаптена к аминогруппам белка-носителя, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате. Наиболее точный расчет состава конъюгата получается с помощью радиоизотопного метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен. [c.177]

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ЭПАГ) стал повседневной процедурой для определения компонентов сложных молекулярных смесей. Электрофоретический перенос полосы на нитро-целлюлозную мембрану (Вестерн-блоттинг) обеспечивает возможность не только тестирования специфичности антител, но и позволяет сконцентрировать макромолекулярный иммуноген для последующего введения его животным. Показано, что окрашенные на белок, вырезанные и тонко измельченные по- [c.52]

Изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью, когда-либо достигавшейся при разделении белков цо зар5 дам [58—64, 92]. Этот метод позволяет разделить белки, велйчины р/ которых различаются всего на 0,01 ед. pH. Иногда Для такого разделения бывает достаточно различия между двумя структурами на одну заряженную группу. При помощи метода изоэлектрофокусирования можно также обнаружить другй различия в зарядах, которые, строго говоря, не связаны с макроскопической егомогенностью белков. Вот некоторые из факторов, обусловливающих такие различия посттрансляционная модификация первичной структуры (например, дезамидирование), связывание лигандов, химическая модификация, вариации в небелковых компонентах, например липидах, углеводах и других простетических группах, ассоциация и диссоциация, изменения окислительно-восстановительного состояния металлоферментов. Если при анализе картины изоэлектрофокусирования иметь в виду эти факторы, то полученные данные могут приобрести дополнительную ценность, поскольку в принципе они позволяют обнаружить микрогетерогенность белковых структур. В настоящее время метод изоэлектрического фокусирования применяют в сочетании с другими электрофоретическими методами, например в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, для получения двумерных карт разделяемых компонентов. В одном направлении производят разделение белков в соответствии со значениями их рД а в другом — в соответствии с размерами их молекул, т. е. в соответствии с их молекулярными массами. При помощи этих методов можно охарактеризовать смеси, содержащие тысячи белков [94]. Еще несколько лет тому назад разделение с таким высоким разрешением было просто немыслимо, а в настоящее время этот метод анализа находит все более широкое и все более успешное применение в различных биохимических исследованиях. [c.126]

В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). Этот метод был существенным щагом вперед по сравнению с обычными методами анализа белков, известными к тому времени. При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе - полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сщивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецнл-сульфат натрия или ДСН (8В8) (рис. 4-48). [c.215]

Характеристика очищенных антител. При использовании in vivo к качеству моноклональных антител предъявляются очень высокие требования. Поэтому характеристике получаемых для этих целей в производственном масштабе антител следует уделять самое тщательное внимание. Необходимо, например, разработать методы определения пикограммовых количеств возможных примесей (например, ДНК или РНК). Если же моноклональные антитела предполагается использовать для диагностических целей, важнее удостовериться в их функциональной пригодности. Как правило, для того чтобы показать, что препарат антител удовлетворяет принятым стандартам, его характеризуют двумя методами -изоэлектрическим фокусированием и электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. [c.49]

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия — это основная процедура во всех обсуждаемых ниже методах двумерного разделения. Описание прибора и основных принципов разделения было сделано ранее (Taka s, 1979). Ниже будет сказано лишь об особых деталях метода, которые применяются в нашей лаборатории и дополняют процедуру, описанную в упомянутой статье. [c.73]

Меченные радиоизотопом надосадочные жидкости всех гибридных культур анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и методом изоэлектрофокусирования. Двадцать культур гибридных клеток продолжали секретировать миеломный IgG, который синтезировала родительская миелома, одиннадцать культур — дополнительный IgM, две культуры — дополнительные молекулы IgG и две — только дополнительные легкие цепи шесть — не секретировали дополнительных Ig-цепей. Один из синтезируемых гибридами IgM и один IgG2b вызывали гемолиз бараньих эритроцитов. Антител к ТНФ-группе не было обнаружено. [c.405]

Важно иметь в виду, что прогресс в биохимии зависит от разработки новых методов анализа, очистки и определения структуры. Например, в области биохимии липидов произошел настоящий переворот после введения в практику гяэо-жвдкостной и тонкослойной хроматографии. Анализ мембранных и многих других белков был крайне затруднен до тех пор, пока не появился метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПЭГ) применение додецилсульфата натрия приводит к солюбилизащш (растворению) ряда белков, которые ранее не удавалось перевести в растворимое состояние. После такой солюбилизации уже можно проводить электрофорез. Разработка методов клонирования и секвенирования (определения последовательности мономеров) ДНК произвела подлинную революцию в изучении нуклеиновых кислот и вообще в биологии. [c.16]

БАМ высокой мол. массы — БАМ-1 ( — 350 кДа) и -БАМ-2 ( 270 кДа) — дают при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия гетерогенную картину. БАМ-2 разделяется на два компонента, а БАМ-1 состоит по меньшей мере из трех жомпонентов. БАМ-1 содержит также полипептиды меньшего размера (называемые легкими цепями 1 и 2), которые имеют мол. массу приблизительно 30 и 28 кДа и присутствуют в соотношении 1 1. БАМ-1 распространен, по-видимому, более широко, чем БАМ-2 он обнаруживается как на микротрубочках интерфазных клеток, так и в митотическом веретене [21]. [c.21]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология