Электрофорез полиакриламидном геле с додецилсульфатом

Рис. 4-49. ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле. Индивидуальные белки образуют комплекс с молекулами додецилсульфата натрия, несущими отрицательный заряд, и мигрируют через пористый гель полиакриламида в виде отрицательно заряженного комплекса ДСН-белок. Поскольку скорость передвижения в этих условиях тем выще. чем меньще размеры полипептида, этот метод может быть использован для определения приблизительной молекулярной массы полипептидной цепи, а также для изучения субъединичного

Рис. 1.11. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в полулогарифмической системе координат).

Рис. 12.30. Графическое определение молекулярной массы белков методом электрофореза в полиакриламидном геле в среде додецилсульфата (по данным Вебера с сотр. [105]).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ В ПРИСУТСТВИИ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТА [c.344]

С помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) можно определить размеры и субъединичный состав белков [27] [c.215]

Заряженные частицы перемещаются в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Уже в первой половине нашего столетия для этого явления было введено понятие "электрофорез" или "электрический перенос". Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами (а) различные молекулы несут на себе различные заряды и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степени (б) их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В простейшем случае разделительная среда (раствор электролита) находится в трубке. Из-за отвода Джоулева тепла на практике зачастую наблюдается искажение зон за счет различных плотностей электролита и конвекционных потоков. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также чтобы увеличить сопротивление трения макро-молекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков. Благодаря изменению степени сшивания геля может быть оптимизирована производительность разделения. При использовании гель-электрофореза белков, денатурированных додецилсульфатом натрия (ДДСН), возможно непосредственное определение их молекулярной массы. Разделение в этом случае основано исключительно на затруднении миграции пробы через гель (без геля все денатурированные додецилсульфатом натрия белки перемещаются с одинаковой скоростью). [c.5]

Изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью, когда-либо достигавшейся при разделении белков цо зар5 дам [58—64, 92]. Этот метод позволяет разделить белки, велйчины р/ которых различаются всего на 0,01 ед. pH. Иногда Для такого разделения бывает достаточно различия между двумя структурами на одну заряженную группу. При помощи метода изоэлектрофокусирования можно также обнаружить другй различия в зарядах, которые, строго говоря, не связаны с макроскопической егомогенностью белков. Вот некоторые из факторов, обусловливающих такие различия посттрансляционная модификация первичной структуры (например, дезамидирование), связывание лигандов, химическая модификация, вариации в небелковых компонентах, например липидах, углеводах и других простетических группах, ассоциация и диссоциация, изменения окислительно-восстановительного состояния металлоферментов. Если при анализе картины изоэлектрофокусирования иметь в виду эти факторы, то полученные данные могут приобрести дополнительную ценность, поскольку в принципе они позволяют обнаружить микрогетерогенность белковых структур. В настоящее время метод изоэлектрического фокусирования применяют в сочетании с другими электрофоретическими методами, например в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, для получения двумерных карт разделяемых компонентов. В одном направлении производят разделение белков в соответствии со значениями их рД а в другом — в соответствии с размерами их молекул, т. е. в соответствии с их молекулярными массами. При помощи этих методов можно охарактеризовать смеси, содержащие тысячи белков [94]. Еще несколько лет тому назад разделение с таким высоким разрешением было просто немыслимо, а в настоящее время этот метод анализа находит все более широкое и все более успешное применение в различных биохимических исследованиях. [c.126]

Для построения калибровочной кривой при определении молекулярных масс используют белки-стандарты тропонин С (18 000 Да), тропонин I (24 000 Да), тропонин Т (38 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да) и бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), а также стандартный набор для определения молекулярной массы белков. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат миозина дает расположенную почти у старта интенсивную полосу тяжелых цепей с м. м. ок. 20 ООО Да и три слабые, но отчетливые полоски легких цепей с м. м. ок. 20 ООО Да для самой тяжелой из них и около 16 000 Да — для самой легкой. Подвижность этих полос в описанных выше условиях высока, поэтому при достаточно большой продолжительности электрофореза эти полоски могут обнаружиться почти у фронта красителя (бромфенолового синего). [c.397]

Определение белкового состава. В большинстве случаев выделяемые мембранные фракции содержат большой набор белков с различной молекулярной массой. Тем не менее определение белкового состава с использованием электрофореза в полиакриламидном геле (в присутствии додецилсульфата натрия) может оказать- [c.66]

Цитохромоксидазы выполняют в аэробных организмах уникальную функцию они соединяются с Ог почти таким же образом, как и гемоглобин, а затем быстро восстанавливают Ог до двух молекул НгО [24а]. Происходит разрыв связи О—О для восстановления требуется четыре электрона. Очевидно, процесс этот сложен и пока еще плохо изучен. Важно отметить, что цитохромоксидаза, содержащаяся в митохондриях млекопитающих, имеет два гема (цитохром а) и два атома u(I) на одну функциональную единицу. Таким образом, при восстановлении обеих молекул цитохрома а и двух атомов меди может быть запасено четыре электрона для последующего восстановления одной молекулы Ог. Химия цитохромоксидазы слабо изучена. Как впервые обнаружил Кейлин, только половина молекул цитохрома а соединяется с СО. Она была названа цитохромом аз. По данным электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, в цитохромоксида-зе дрожжей имеется шесть или семь субъединиц с мол. весом от 5 000 до 42 000 [24Ь, с]. Интересно отметить, что три наиболее крупные субъединицы, по-видимому, кодируются генами митохондриальной ДНК. Группы гема присоединены к пептидам меньшего размера. Было высказано предположение, что в интактном ферменте молекула Ог вначале связывается между атомом железа цитохрома аз и ионом двухвалентной меди aV—Ог—Си+. На следующей стадии происходит двухэлектронный процесс восстановления Ог с образованием перекисной структуры и далее двух молекул воды. [c.376]

Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю. Самый простой спектрофотометрический способ заключается в регистрации изменения поглощения раствора конъюгата при определенной длине волны по сравнению с исходным белком-носителем. Можно также рассчитать соотношение компонентов конъюгата из данных по молекулярной массе, полученных электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата. Если конъюгат получили путем пришивки гаптена к аминогруппам белка-носителя, то его состав можно определить по титрованию свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате. Наиболее точный расчет состава конъюгата получается с помощью радиоизотопного метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен. [c.177]

Не меньшей популярностью пользуется в настоящее время и метод электрофореза в полиакриламидном геле. Добавляя к раствору акриламида, налитому в стеклянные трубки, различные количества мономеров (например, метиленбисакриламид, этилендиакрилат), образующих в процессе полимеризации поперечные сшивки, можно получить гели с различной степенью связанности [137, 404]. Устойчивость к денатурирующим растворителям, например к 8 М раствору мочевины или 1 %-ному раствору додецилсульфата натрия, составляет еще одно важное преимущество этих гелей. При наложении разности потенциалов белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и вирусы передвигаются в этих гелях на характерные расстояния, которые зависят главным образом от их молекулярного веса (или веса частицы), а также от степени связанности сшивок геля. Разделившиеся вещества образуют характерные полосы, которые можно выявить либо с помощью методов окрашивания или локального осаждения, либо (в случае разделения радиоактивных веществ) с помощью метода радиоавтографии (см. гл. XI, разд. Б). Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле такова, что с помощью этого метода можно обнаружить и идентифицировать приблизительно 37 видов рибосомных белков [508]. То, что разделение белка на многочисленные полосы происходит в силу действительного различия между белками, а не в результате каких-то артефактов, теперь уже не вызывает солшений. Однако известно, что разделяться на отдельные полосы могут не обязательно совершенно различные вещества, но и такие близкие между собой вещества, как, например, один и тот же белок, у которого часть молекул содержит одну лишнюю амидную (— СО — NH2 С00 ) группу, а другая часть — ацетильную (—NH+— NH — СОСН3) группу [136]. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле [c.61]

Выделение из мембран индивидуальных компонентов производится с помощью детергентов (например, додецилсульфата натрия), солюбилизирующих нерастворимые вещества, и разделения полученных белков путем электрофореза в полиакриламидном геле. [c.334]

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения молекулярной массы белков также строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11). Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение для определения молекулярной массы субъединиц белка. [c.46]

Электрофорез проводят в пластинах полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия на приборе для электрофореза с вертикальным расположением пластин производства объединения Хийу Калур (ЭССР). Основные и рабочие растворы готовят по методике Лэммли (с. 121). [c.397]

Сукцинат убихинон-редуктаза (СУР) катализирует окисление сукцината убихиноном. По данным электрофореза, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия фермент состоит из 3 —4 полипептидов. Субъединицы с молекулярными массами 70 000 и 28 000 Да представляют собой собственно сукцинатдегидрогеназу, в субстратсвязывающем центре которой происходит дегидрирование сукцината низкомолекулярные компоненты комплекса И (м. м. ок. 15 000 Да) придают сукцинатдегидрогеназе реактивность по отношению к убихинону, чувствительность к специфическим ингибиторам и, по-видимому, принимают участие в связывании фермента с мембраной. Выделение препарата СУР основано на экстракции фермента из мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и концентрировании препарата охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование сульфатом аммония и очистка на кальдий-фосфатном геле позволяют получить фермент в высокоочищенном состоянии с каталитической активностью около 25 мкмоль окисленного сукцината в 1 мин на [c.423]

При электрофорезе белков плазматических мембран в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (гл. 2, разд. 3.6) получают от 1 до 6 четко выраженных полос и, как минимум, еще 35 менее интенсивных полос, соответствующих мол. весам в интервале от 10 000 до 360 000 [28]. Однако некоторые очень важные мембранные белки, апример (Na+-f К+)-зависимая АТРаза (разд. Б.2.в), присутствуют в столь незначительных количествах (в одном эритроците их содержится всего несколько сотен молекул [3, За]), что эти белки не удается идентифицировать на электрофореграмме. Митохондриальные мембраны могут иметь еще более сложный состав, чем плазматические, тогда как состав миелина несколько проще. [c.352]

При электрофорезе в полиакриламидном геле заряд белков не играет решающей роли в определении подвижности данной макромолекулы — особенно при электрофоретическом разделении кислых белков, обычно диспергированных в 0,1%-ном растворе додецилсульфата натрия. В этих условиях основные группы белка образуют комплексы с додецилсульфатом натрия и благодаря этому белки, подобно нуклеиновым кислотам, ведут себя главным образом как полианионы. Разделение в этом случае происходит в основном за счет различий в молекулярных весах, причем более мелкие компоненты движутся впереди более крупных. Путем стандартизации таких гелей с помощью белков или нуклеиновых кислот известного молекулярного веса можно с достаточной точностью определить молекулярный вес неизвестных компонентов [435]. Следует особо отметить, что если исследуемый белок состоит из двух или большего числа цепей, связанных друг с другом дисульфидными связями, и если разделение при этом проводят, как обычно, в присутствии сильных денатурирующих и восстанавливающих агентов, то полученные данные относятся к молекулярным весам структурных субъединиц или даже пептидных цепей. [c.62]

В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). Этот метод был существенным щагом вперед по сравнению с обычными методами анализа белков, известными к тому времени. При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе - полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сщивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецнл-сульфат натрия или ДСН (8В8) (рис. 4-48). [c.215]

Ниже описываются три общепринятых метода разделения нептидов. Первый из них ПААГ — ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), обычно в одномерном варианте. Разрешение пептидных фрагментов достигается благодаря различиям в их относительных подвижностях, не всегда отражающих истинные молекулярные массы. Очень важно, что электрофореграмму фрагментов одного белка можно сравнивать с электрофореграм- [c.223]

Эти белки характеризуют обычно посредством электрофореза в полиакриламидном геле, проводимого после диссоциации компонентов мембран с помощью додецилсульфата натрия (ДДС-N3). Когда в подходящих условиях происходит диссоциация, на электрофореграммах наблюдается несколько зеленых полос, соответствующих белково-хлорофилловым комплексам (рис. 6.8). Вполне вероятно, что в тилакоидах все хлорофиллы находятся в форме таких комплексов [73]. Некоторые комплексы включают хлорофилл а и хлорофилл б это собирательные антенны для фотонов или ССХБ (светособирающий хлорофилл — белок) [107]. На эти комплексы приходится до 50 % белков и хлорофиллов ла- [c.240]

Эти данные определены методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Секвенирование кДНК (гл. 12) дает несколько более высокие значения (50 200 для цепи, связывающей агонист, и 268 ООО для полного рецепторного комплекса). [c.204]

Электрофоретическому разделению веществ мешает их диффузия. Среда, в которой мигрируют молекулы, сама по себе в какой-то мере препятствует диффузии, однако еще в большей степени можно подавить этот эффект и одновременно увеличить подвижность сравнительно небольших молекул с помощью высокого напряжения (высоковольтный электрофорез). В некоторых случаях гели выполняют роль сит. Например, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия разделение предварительно дентурированных белков происходит в соответствии с размерами их молекул. При проведении электрофореза в градиентном геле разделяемые вещества мигрируют в направлении уменьшения диаметра пор геля, и поэтому с увеличением расстояния от старта задерживаются все более мелкие молекулы. [c.28]

Этот метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата (808-РАСЕ) фракционирует белки в основном по молекулярной массе. На основании результатов такого разделения ученые пришли к вьшоду, что глобулиновые запасные белки злаков характеризуются меньшей сортовой изменчивостью, чем проламины. Метод 808-РА0Е обнаруживает незначительные различия среди девяти сортов овса и лишь немногим более — методом изоэлектрического фокусирования (1ЕР). Более выраженной оказалась изменчивость при анализе проламинов (авенинов) из тех же сортов вышеупомянутыми методами. Крайне низкой оказалась также электрофоретическая изменчивость глобулинов риса. [c.384]

Иммунологические методы пгароко используются для идентификации мембранных компонентов, их локализации, оценки количества, выделения. Это методы получения поликлональных и моноклональных антител к компонентам мембран, иммуно-блоттинг (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата на рия с перенесением разделенных белков на нитроцеллюлозные фильтры для последуюп] его выявления с по- [c.202]

Убедительные результаты были получены в лаборатории А. Д. Мирзабекова В. Л. Карповым и О. В. Преображенской. Они разработали метод гибридизации с тенями гистонов . Для этого ДНК сшивали с гистонами с помощью диметилсульфата в условиях, когда пришивается в среднем одна молекула гистона на отрезок ДНК длиной около 200— 300 п. н. Затем ДНК фрагментировали и проводили двумерный электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После прогона в первом направлении разрушали пришитые к ДНК гистоны протеиназой и вели разгонку во втором направлении уже свободной ДНК. Так как при первом раунде электрофореза разные гистоны по-разному замедляли движение фрагментов ДНК, то после второго прогона выявлялось несколько диагоналей [c.147]

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ЭПАГ) стал повседневной процедурой для определения компонентов сложных молекулярных смесей. Электрофоретический перенос полосы на нитро-целлюлозную мембрану (Вестерн-блоттинг) обеспечивает возможность не только тестирования специфичности антител, но и позволяет сконцентрировать макромолекулярный иммуноген для последующего введения его животным. Показано, что окрашенные на белок, вырезанные и тонко измельченные по- [c.52]

Поскольку гель-фильтрация дает безусловно лучшие выходы при разделении крупных пептидов, чем ионообменная хроматография, оптимальный метод расщепления белка в двухстадийном анализе (рис. 10.2) удобно выбирать на основе результатов аналитического электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДНС), При четком разделении полос в геле целесообразно для препаративного фракционирования пептидов применять гель-фильтрацию. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН используется также для ко1ггроля полноты процесса расщепления белка химическими реагентами. [c.349]

Характеристика очищенных антител. При использовании in vivo к качеству моноклональных антител предъявляются очень высокие требования. Поэтому характеристике получаемых для этих целей в производственном масштабе антител следует уделять самое тщательное внимание. Необходимо, например, разработать методы определения пикограммовых количеств возможных примесей (например, ДНК или РНК). Если же моноклональные антитела предполагается использовать для диагностических целей, важнее удостовериться в их функциональной пригодности. Как правило, для того чтобы показать, что препарат антител удовлетворяет принятым стандартам, его характеризуют двумя методами -изоэлектрическим фокусированием и электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. [c.49]

Рассчитана на основании данных о первичной структуре рецепторов. Молекулярная масса / -белков установлена методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата нагоия. [c.58]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология