Вирус дифференциальное центрифугирование

Материал для исследования — фекалии больного. Для выделения вируса готовят 10 — 40%-й экстракт фекалий, гомогенизированный в фосфатном буфере (pH 7,4). Крупные частицы удаляют низкоскоростным центрифугированием. Вирус концентрируют, комбинируя дифференциальное центрифугирование с экстракцией органическими растворителями (хлороформом), фильтрацией через агарозу (сефарозу L-2B) и плотностным центрифугированием в хлориде цезия. [c.302]

Для большинства вирусных суспензий первый этап очистки проводится путем дифференциального центрифугирования, сначала низкоскоростного (4000 ) — для отделения обломков крупных клеток, а затем высокоскоростного (40 ООО ) - для осаждения вирусов. Применение флокулянтов на первой стадии представляется весьма проблематичным, поскольку их введение в вируссодержащие жидкости приводит к совместному осаждению как вирусов, так и осколков клеток и биополимеров. Селективное осаждение вирусов — также трудноразрешимая [c.122]

Молодые растения табака заражают TMV, срезают, погружают с черешками в раствор Р, инкубируют 6 сут при комнатной температуре и затем замораживают. Радиоактивный вирус выделяют, подвергая замороженные листья гомогенизации и дифференциальному центрифугированию, после чего, экстрагируя фенолом, извлекают РНК. [c.256]

Даже применение дифференциального центрифугирования, одного из наиболее мягких методов выделения вирусов, оказывает неблагоприятное воздействие на некоторые вирусы (например, на вирус гриппа). Происходит это потому, что под действием ускорения, достигающего приблизительно 100 ООО g, происходит уплотнение вирусных частиц на дне кюветы. Такие вирусы можно успешно выделять, наливая на дно пробирки концентрированный раствор сахарозы. [c.34]

После того как зараженная клеточная культура подвергается дифференциальному центрифугированию или какой-либо другой процедуре фракционирования, необходимо идентифицировать фракции, содержащие нужный материал. При необходимости можно использовать методы, описанные в разд. 4.1 и 4.2, но они требуют довольно много времени альтернативные подходы состоят в том, что во фракциях градиента по поглощению в ультрафиолете идентифицируют пики РНК или белка. или же в материал, подвергаемый очистке, включают в качестве маркера радиоактивно меченный вирус. Затем в аликвотах из каждой фракции любым стандартным методом (например, с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика) можно определить радиоактивность. Если есть возможность получить радиоактивно меченный материал, данный метод очень удобен, поскольку он занимает мало времени, точен и прост в исполнении. [c.57]

Для очистки аденовирусов обычно используют комбинированный метод, состоящий из экстракции вируса из клетки дезоксихолатом натрия, обработки нуклеазами и фреоном 113 и равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия [855], Иногда применяют метод изоэлектрической преципитации, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и сефадексе Г 200 и метод двухфазных полимерных систем. При дифференциальном центрифугировании происходят большие потери вируса, по-видимому, вследствие его агрегации. [c.11]

Поскольку вирусы довольно лабильны, для их очистки используют следующие методы дифференциальное центрифугирование, обработку нуклеазами, хроматографию па фосфате кальция и центрифугирование в градиенте плот-ности сахарозы, цитрата и тартрата калия и хлористого цезия. [c.12]

Наиболее приемлемым методом очистки вирусов этой группы является центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и цитрата калия. Применявшиеся ранее такие методы, как дифференциальное центрифугирование, [c.12]

Смит с сотр. [746] выделяли ДНК из вируса полиомы следующим образом. Равные объемы вирусной суспензии, очищенной дифференциальным и градиентным центрифугированием, и 10%-ный раствор додецилсульфата натрия при pH 7,0 смешивают и нагревают при 65" 2 часа. После добавления ацетата аммония до концентрации 0,1 М ДНК осаждают этанолом (1 2). Преципитат растворяют в 0,1 М ацетате аммония и дважды переосаждают этанолом. [c.159]

Для очистки выделенных штаммов вирусов от материалов клеток хозяина используют чаще других методов адсорбцию на фор-малинизироваиных куриных эритроцитах с последующим элюированием физиологическим раствором хлористого натрия [1] и метод дифференциального центрифугирования при низких и высоких скоростях вращения [2]. Однако оба метода трудоемки и не обеспечивают ПОЛНО очнст1- и вируса от сонутству ощнх веществ. [c.80]

Штаммы вируса гриппа и парагриппа размножали в 10—11-дневных куриных эмбрионах при 35° после заражения их соответствующим вирусом в аллантоисную полость при разведении вируса 1 1000. Затем эмбрионы охлаждали при 4° в течение 12 час. и собирали аллантоисную жидкость, содержащую вирус. Вирусы аллантоисной жидкости концентрировали и очищали сначала адсорбцией на хорошо отмытых формалинизированных куриных эритроцитах с последующей элюцией физиологическим раствором хлористого натрия, а потом дифференциальным центрифугированием, после чего осадок вирусов суспендировали и хроматографировали на колонке с сефадексом Г-75. [c.77]

При выделении вирусов из таких тканевых экстрактов наилучшие результаты дают следующие методы а) дифференциальное центрифугирование б) осаждение сульфатом аммония в) центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы г) центрифугирование в градиенте плотности СвС д) экстракция растворителями и нротиво-точное распределение между частицами растворенного полимера и е) обработка ферментами [469, 470]. [c.35]

Химические методы. С помощью высаливания сернокислым аммонием и дифференциальным центрифугированием в высоко-очищенном состоянии был получен целый ряд растительных вирусов. Однако получить этим методом в чистом виде вирусы животных не удается. В настоящее время метод высаливания сернокислым аммонием был использован для лредварнтельного концентрирования вирусов ящура, полиомиелита, реовируса, гриппа, болезни Ньюкасла и др. Кокс с сотр. [267] в 1947 г. успешно применили для концентрирования вируса гриппа метод преципитации метанолом. В дальнейшем этот метод был использован также для предварительного концентрирования вирусов гриппа, паротита, полиомы, ящура, болезни Тешена и др. [c.42]

Метод дифференциального центрифугирования для конденз ри рования и частичной очистки вирусных препаратов используется уже 30 лет. Недостатки этого метода были устранены Брекком [216], который ввел в 1951 г. метод зонального центрифугирования в градиенте сахарозы. В 1957 г. Мезельсон, Сталь и Виноград [565] разработали метод равновесного дентрифугарования в градиенте плотности, В настоящее время эти два метода являются наиболее совершенными методами очистки и фракционирования вирусов. [c.44]

Ультрацентрифугирование, по-видимому, самый расирост-раненный метод концентрирования, очистки и фракционирования вирусов. Превосходные препаративные ультра-центрифуги позволяют обрабатывать большие количества материала при низкой температуре. Этот метод относительно безвреден для многих вирусов, и его принципы хорошо изучены. Широко применяются оба метода — дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности. [c.55]

Метод ультрацентрифугирования основан на разделении частиц по их массе в гравитационном поле, Вируссодержащая суспензия содержит набор частиц, начиная от ионов неорганических солей до обломков клеток. Скорость осаждения в большей степени зависит от размера (диаметра) и плотности частицы. Так как плотность различных компонентов клетки и вирусов находится в сравнительно небольшом диапазоне — 1,1—1,4 г/см , то осаждение подобных частиц прежде всего зависит от их размера Например, ядра оседают при 800 g за 10—15 минут, митохондрия-дри 10000 g за 30 минут, а большинство известных вирусов — при 30000 — 100000 за 0,5—3 часа. При низкоскоростном центрифугировании из вируссодержащей суспензии удаляются обломки клеток и их компоненты. При ультрацентрифугировании надосадка вирусные частицы оседают, а основная часть растворимого белка и другие низкомолекулярные соединения остаются в надосадочной жидкости Таким образом, с помощью цикла дифференциального центрифугирования удается разделить вирусную суспензию на ряд фракций, содержащих однородные по скорости осаждения частицы. Но вирусный осадок в таком случае обычно содержит, кроме вируса, некоторое количество сопутствующих веществ с одинаковыми коэффициентами седиментации 293]. Большую часть этих сопутствующих веществ в дальнейшем можно отделить от вирусных частиц, так как они отличаются по своим свойствам. [c.55]

FL [349]. Сусдензию клеток (после появления цитопатиче-ского эффекта) трижды подвергали замораживанию и оттаиванию и центрифугировали дри 6600 g 20 минут. Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость центрифугировали при 77 ООО g 180 минут. Дифференциальное центрифугирование повторяли дважды. Вирусную суспензию пропускали через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой для удаления примесей (вирус при этом не адсорбировался) к вновь осаждали вирус. В дальнейшем вирус очищали центрифугированием в градиенте сахарозы 50—20% в течение 45 минут. [c.57]

Дифференциальное центрифугирование как метод очистки и концентрирования весьма эффективен нри очистке вирусов растений. Этим методом в комбинации с каким-либо методом осаждения (сульфат аммония и др.) можно получить высокоочищенные суспензии вирусов растений. Однако использовать для очистки вирусов животных и человека только один метод дифференциального центрифугирования недостаточно, чтобы получить высО коочищенную вирусную суспензию. Поэтому этот метод ис-пользуют либо в конце после ряда других стадий очистки, (ионообменная хроматография, гельфильтрация), либо перед очисткой вируса для уменьшения объема вируссодержащего материала [c.58]

Удобен и эффективен метод концентрирования и очистки вируса гриппа из аллантоисной жидкости при помощи сернокислого бария [574]. Сульфат бария в виде водной суспензии (12,5 г на 100 мл дистиллированной воды) прибавляют к равному объему вируссодержащей аллантоисной жидкости и встряхивают 10 минут при комнатной температуре. Смесь оставляют на ночь при 4°. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок сульфата бария ре суспендируют в Vio исходного объема 0,25 М цитрате натрия, pH 8. Осадок перемешивают в гомогенизаторе нри комнатной температуре 5 минут. После стояния в течение ночи при 4 эяюат отсасывают, а осадок промывают 0,25 М раствором цитрата натрия, pH 8. Элюаты объединяют и центрифугируют при 800 g в течение 15 минут. После цикла дифференциального центрифугирования вирус ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,2. Выход вируса составляет 70—75% при 500-кратной очистке. [c.103]

Сефадекс Г-25 успешно применялся для очистки вируса Сендай после цикла дифференциального центрифугирования. Вирус с колонки элюировали дистиллированной водой. Полученный очищенный препарат вируса Сендай почти но содержал балластных веществ [93]. Одцако сефадекс этого типа был неэффективен нри очистке полиовируса от экстраневральных белков клеточной культуры тка [c.140]

Гельфильтрацию на сефадексе Г-75 успешно использовали для дополнительной очистки вируса Сендай Концентрированный препарат вируса подучали либо дифференциальным центрифугированием, либо циклом адсорбции-элюции на формалинизированных эритроцитах с последующим ультрацентрифугированием. Такие препараты содержали значительное количество примесей, преимущественно высокомолекулярных пептидов, выявляющихся нри высоковольтном электрофорезе на бумаге. На колонку с сефадексом Г-75 наносили вирусную суспензию объемом не более Ve—Ve объема внутренней фазы геля. Элюирование веди дистиллированной водой. В очищенных препаратах примеси пептидов отсутствовали, лишь в некоторых случаях на электрофореграммах выявлялось незначительное количество пептидов с высоким молекулярным весом Надо отметить, что при использовании аллантоисной жидкости без предварительных концентрирования и очисткг вируса результаты были менее удовдетворительными, xai как часть белков элюировалась вместе с вирусом [97, 99] [c.140]

Иногда препараты вируса высокой степени чистоты можно получить путем повторного применения одного и того же метода. Например, иногда препарат можно подвергнуть повторной кристаллизации с помощью сульфата аммония или провести несколько циклов дифференциального центрифугирования. Последний метод предпочтителен для удаления макромолекулярных примесей, так как они не растворяются при ресуспендироваиии осадка, полученного после высокоскоростного центрифугирования. Однако при этом часто наблюдаются и потери вируса, что происходит либо вследствие того, что часть вируса или весь он становится нерастворимым, либо из-за того, что для растворения осадка было недостаточно времени. [c.44]

Вследствие очень высокой лабильнбсти вирусов этой группы очистку производят при помощи дифференциального и градиентного центрифугирования в сахарозе, цитрате калия или фиколле. Иногда применяют хроматографию на гидрокснлапатиге. [c.10]

По эффективности очистку вирусов на сефадекса обычно приравнивают к методу дифференциального цент рифугярования. Но в некоторых случаях этот мете эффективнее высокоскоростного центрифугирования [20 745] Недостатком метода гельфильтрации является то, чт [c.140]