Матрицы для секвенирования

В основе метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977а], называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежал принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста. [c.46]

Для секвенирования используют также систему на основе фага М13. В ДНК фага встраивают фрагмент ДНК длиной до 500 нуклеотидов, который хотят секвенировать. Эту рекомбинантную ДНК легко получить в одноцепочечной форме и использовать ее в качестве матрицы для секвенирования вставки. Можно использовать также двухцепочечные плазмиды, содержащие клонированную ДНК. [c.103]

Современные методы секвенирования (метод химической деградации ДНК Максима — Гилберта и метод синтеза ДНК на матрице в присутствии терминаторов синтеза Сэнгера) в своей основе разработаны в 1977 г. Идея методов состоит в следующем [c.284]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Появление продуктов ПЦР, не соответствующих по размерам ожидаемым. Такой результат ПЦР чаще всего указывает на артефакт, но иногда может быть и открытием нового полиморфизма в матричной ДНК, возникшего в результате делеции или вставки. По крайней мере, подобный результат должен настораживать. Система амплификации на основе ПЦР, как и любая другая искусственная генетическая система, является вещью в себе , законы существования которой не вполне понятны. Это особенно относится к тем сложным случаям амплификации, когда в качестве матрицы используется ДНК целого большого генома, например, генома человека. В данном случае единственным доказательством того, что амплифицирован нужный локус, будет подтверждение происхождения продукта на уровне его первичной структуры. Быстрее всего убедиться в адекватности продукта можно путем исследования сайтов рестрикции. Однако, даже наличие предсказанных сайтов из-за сложности исследуемого объекта не дает полной гарантии того, что артефакта удалось избежать. Окончательным доказательством амплификации нужного генетического локуса может служить только полное секвенирование продукта ПЦР. [c.205]

Рис. 2.3. Принцип пол)гчения с помощью расщепления экзонуклеазой III одноцепочечной матрицы ДНК, пригодной для секвенирования путем

Рис. 2.8. Секвенирование двуцепочечной матрицы ДНК путем вытеснения одной цепи Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I

Среди структурных белков особое место занимают кератины, поскольку они были первыми белками, изученными Астбюри метолом диффракции рентгеновских лучей. Их нерастворимость и биохимическая инертность не способствовали, однако, достаточному уровню активности исследований. Кератины образуют защищающие от внешней среды барьеры типа рогов, копыт, когтей, волос, шерсти и перьев. В перьях содержатся р-структуры, в то время как для волос и шерсти характерны а-спиральные структуры. Последние состоят из белков с низким содержанием серы эти микрофибриллы окружены матрицей двух других типов, одной с высоким содержанием глицина и тирозина, а другой—с высоким йроцентом серы. Во время синтеза прокератина в эпителиальных клетках в богатых серой белках имеются большие количества тиольных групп, образующих впоследствии дисульфидные связи, делающие кератин более жестким. Потерю волосами механической прочности при их обработке отбеливающими или восстанавливающими агентами (завивка-перманент) можно частично объяснить за счет расщепления дисульфидных связей. Восстановление и карбо-ксиметилирование дисульфидных связей (см. разд. 23.3.3) сделали возможным солюбилизацию и фракционирование некоторых компонентов кератина для последующего секвенирования [29]. В одном [c.572]

Наиболее широко среди перечисленных подходов применяется SS P. Суть метода состоит в следующем. Как можно большее (по возможности все) число экзонов исследуемого гена по отдельности амплифицируют методом ПЦР, используя в качестве матрицы ДНК больных и здоровых индивидов. Каждая пара праймеров выбирается из последовательностей, фланкирующих экзон, или из его концевых участков. Кроме того, используя данные секвенирования, выбирают праймеры для амплификации 5 -области, предшествующей первому экзону гена, 3 -области, следующей за последним экзоном, и участков, содержащих сайты сплайсинга. [c.467]

Так как в основе секвенирования по Сэнгеру лежит процесс репликации ДНК, то основным ферментом является ДНК-полимераза (используют ДНК-полимеразу I). В присутствии одноцепочечной ДНК-матрицы, короткого полинуклеотидного праймера и нуклеотидов по принципу комплементарности будет происходить синтез второй цепи ДНК. При этом удлинение цепи будет проходить до тех пор, пока вместо дезокси-нуклеотида не присоединится дидезоксинуклеотид. Присоединение последнего приведет к остановке синтеза. [c.31]

МО иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осушествить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод—метод Сэнгера—базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. [c.44]

Если при амплификации геномной ДНК позвоночных в качестве праймеров для ПЦР используют олигонуклеотиды длиной 20 нуклеотидов и более, то процесс этот довольно специфичен и амплифицируется только один фрагмент ДНК- Однако иногда среди продуктов реакции наблюдается накопление фрагментов, происхождение которых трудно объяснить. А поскольку эти фрагменты могут мешать последующему анализу (РНКазному расщеплению, ДГГЭ, секвенированию), то рекомендуется провести еще одну серию амплификаций, с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. Этот метод, именуемый nested oligo [22], состоит в следующем продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента (рис. 6, Б). Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа. [c.139]

Еще одно неудобство, вызванное прямым секвенированием продуктов ПЦР, обусловлено способностью двух цепей амплифицированного фрагмента к быстрой реассоциации, что мешает отжигу секвенационного праймера на комплементарной последовательности или блокирует реакцию достройки комплекса затравка — матрица. Устранить это препятствие можно, применяя один из вариантов стандартного метода секвенирования двухцепочечной ДНК или модифицируя ПЦР с целью получения одноцепочечных продуктов. [c.185]

Поскольку в результате цепной амплификации образуются идентичные фрагменты специфичной ДНК, сразу же может быть осуществлено клонирование или секвенирование продуктов реакции. Матрицей для ПЦР-амплификации могут служить как геномная ДНК, так и кДНК, синтезированная путем обратной транскрипции РНК- Чувствительность метода позволяет обнаружить и амплифицировать единственную молекулу ДНК. При ЦР и наличии нерадиоактивных материалов полимеразная цепная реакция обещает стать в будущем стандартной молекулярно-биологической процедурой. Можно предположить, что велика будет и ее роль в диагностике наследственных и инфекционных заболеваний. [c.189]

Для секвенирования ДНК по методу Сэнгера ее клонируют в однонитевых фагах. Основа метода Сэнгера — синтез радиоактивных копий однонитевой ДНК от фиксированного олигонуклеотида-затравки в присутствии нуклеотидспецифичных терминаторов синтеза ДНК. Чтобы облегчить выделение однонитевых матриц, Дж. Мессингом сконструирована серия векторов на основе фага М13, содержащего в капсидах однонитевую ДНК. Биология размножения М13 чрезвычайно удобна для создания таких векторов. М13 реплицируется в клетке в виде двунитевой репликативной формы, которую можно легко выделить и использовать для клонирования чужеродной ДНК как обычную плазмидную ДНК. В то же время такие рекомбинантные клоны выделяют и из суспензии зрелых частиц фага в однонитевой форме. Сконструированные Мессингом векторы содержат полилинкер, т. е. последовательность, являющуюся мишенью для нескольких рестриктаз, для клонирования ДНК в области фагового генома несущественной для его размножения кроме того, при вставках чужеродной ДНК изменяется цвет фаговых негативных колоний (пятен лизиса на газоне бактериальной культуры) на среде с индикаторным красителем. Для секвенирования олигонуклеотид- [c.285]

В методе, предложенном примерно в то же время Сенджером и соавторами, использован другой (ферментативный) подход к решению задачи секвенирования-ДНК (Запдег е1 а1., 1977]. Однонитевая ДНК здесь выступает в качестве матрицы для синтеза с помощью ДНК-полимеразы I радиоактивно меченной комплементарной нити ДНК. Этот синтез обрывается из-за присутствия в обычной смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов еще и некоторого количества одного из дидезоксирибонуклеозидтри-фосфатов. Включение в синтезируемую нить ДНК такого дефектного нуклеотида делает невозможным ее дальнейшее удлинение. В результате этого синтез обрывается, причем на вполне определенном нуклеотиде, дефектный аналог которого введен в данную реакционную смесь. И опять для множества нитей матричной ДНК получается совокупность всех возможных фрагментов различной длины, радиоактивно меченных и оканчивающихся на одном и том же заранее известном нуклеотиде. [c.133]

Основным классом условно-летальных мутантов, используемым для изучения функции парамиксовирусных генов, являются / -мутанты. Низкий уровень рекомбинации не позволяет построить карту парамиксовирусов с помощью генетических методов. Однако информация о взаимном расположении генов была получена в серии экспериментов по прерыванию процесса транскрипции вследствие УФ-повреждения матриц [13], а также с помощью методов молекулярного клонирования и секвенирования [16]. Описаны, но не нашли широкого применения природные и безусловно-летальные мутации. Правда, спонтанный мутагенез можно исследовать с помощью моноклональных антител. [c.479]

Другой способ получения меченного по одному концу фрагмента ДНК также на основе одноцепочечного фага М13 описан другими авторами [Rosenthal et al., 1990]. В данной работе осуществлялся отжиг меченого праймера на одноцепочечной матрице ДНК с таким расчетом, что построение комплементарной цепи с помощью высокопроцессив-ной ДНК-полимеразы приводило, в первую очередь, к копированию вставки, секвенирование которой и предполагалось. [c.32]

Выше на рис. 2.2 схематично показан весь описанный выше процесс, но следует отметить, что он несколько идеализирован. При его выполнении экспериментаторов подстерегает множество нюансов, которые могут свести на нет все предварительные усилия. Так, и подготовка самой матрицы к секвенированию, и выбор затравочной молекулы, и определенное соотношение дНТФ/ддНТФ, зависящее, главным образом, от используемой ДНК-полимеразы, и мечение вновь синтезируемой цепи ДНК, и параметры секвенирующего геля, и даже особенности радиоавтографии зависят от конкретных задач и требуют тщательного исполнения. В этой связи последующие разделы этой главы и некоторые другие главы будут посвящены подробному анализу составляющих процесса ферментативного секвенирования ДНК. [c.48]

Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплементарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса. Так, если для метода секвенирования ДНК химической деградацией было необходимо наличие одно- или двуцепочечного фрагмента, нe 5ш eгo на одном (гомогенном) из своих концов единственную метку, то для секвенирования ферментативным методом необходимо наличие немеченной матрицы ДНК и при этом желательно одноцепочечной. Хотя, справедливости ради, следует отметить, что матрица ДНК, несущая какую-либо метку (включая и радиоактивную), в большинстве случаев не окажет заметного влияния на заключительный радиоавтограф из-за большой разницы в размерах самой матрицы и вновь синтезированной в условиях терминации цепи ДНК. Что касается матрицы ДНК, один из концов которой несет метку в виде молекулы биотина, то в этом случае возможна ее сорбция на твердой фазе, например, на магнитных частицах со стрептавидином и проведение так называемого твердофазного секвенирования. При этом выхода биотинилированной метки в заключительный раствор терминирующей смеси, содержащей комплементарную цепь ДНК, меченную уже как-то по-другому и предназначенную для нанесения на секвенирующий гель, даже не произойдет. [c.48]

Несмотря на то, что с помощью фаговых или фагмидных векторов получение одноцепочечных молекул ДНК не представляло особых проблем, желание не тратить на очистку одноцепочечной ДНК от прочно связанных фаговых белков заставляло исследователей разрабатывать подходы к секвенированию двуцепочечных молекул ДНК, не останавливаясь даже перед фактом, что качество получаемых результатов при секвенировании двуцепочечной ДНК всегда заведомо хуже, чем одноцепочечной. (Здесь понятия качество секвенирования и количество определенных при этом нуклеотидов очень тесно связаны, поскольку при более высоком качестве полос на радиоавтографе секвенирующего геля прочитать можно будет гораздо большее их количество.) Так, не взирая на потенциально худшие результаты, большое число работ посвящено описанию различных подходов по подготовке двуцепочечных матриц ДНК, пригодных для ферментативного секвенирования дидезокси-методом. Такой, казалось бы, неразумный подход объясняется повышением общей производительности всего процесса секвенирования ДНК за счет экономии времени как на очистку одноцепочечных матриц ДНК, так и на проведение необходимого переклони-рования вставки в специальный фаговый или фагмидный вектор. [c.54]

Был описан интересный способ получения одноцепочечной матрицы ДНК, легший позднее в основу такого высокопроизводительного метода как твердофазное секвенирование (рис. 2.7) [Stahl et al., 1988]. В цитируемой работе фрагмент ДНК, меченный биотином, сорбировался на твердой фазе в виде авидин-агарозы. После этапов денатурации щелочью и последующей отмывки на оставшейся одной цепи ДНК, связанной через биотин-авидиновый комплекс с агарозой, отжигался секвенирующий праймер и шло построение комплементарной цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы в условиях терминации. Затем еще один раунд щелочной денатурации приводил к высвобождению новосинтезированных цепей ДНК, пригодных для их разделения секвенирующим гель-электрофорезом. Справедливости ради следует отметить, что авторы в данной статье упоминают о принципиальной возможности повторения циклов отжига праймера и построения цепи по сорбированной матрице, что [c.56]

Другой способ секвенирования двуцепочечной матрицы ДНК заключается в вытеснении одной цепи за счет самого фермента Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I, для которого характерна подобная активность [Ри е1 а1., 1997]. С этой целью к определенному концу рестриктазного фрагмента ДНК (предварительно дефосфорилированно- [c.57]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология