Вставки геномной ДНК

Как установить, что вставка геномного клона содержит кодирующую область гена [c.482]

Как отмечается в разд. 9.6.3, в ряде случаев желательно иметь воз.можность быстро выделить провирусные последовательности из клеток млекопитающих путем молекулярного клонирования,— например, чтобы проанализировать структуру трансдуцированных последовательностей, если ретровирусный вектор использовался для удаления интронов из геномной ДНК-вставки [19]. Для решения этой задачи могут оказаться весьма полезными челночные векторные системы, облегчающие перенос рекомбинантов между животными и бактериальными клет ками. Такие векторы содержат эукариотическую область нача- [c.284]

Самое простое правило, которым следует руководствоваться при подготовке последовательностей для клонирования в ретровирусных векторах, — уменьшение их длины до того минимума, который только необходим для экспрессии белка. Это позволит избежать непредсказуемых трудностей сопряженных с экспрессией или лабильностью системы. В любом случае вставка должна быть достаточно мала, чтобы суммарный размер геномной РНК, предназначенной для упаковки, не превышал 10—И т. п. н. [14]. Идеальным можно считать фрагмент ДНК, включающий полную открытую рамку считывания с о - и З -фланкирующими последовательностями, которые были бы как можно более короткими. Особое внимание следует уделить элиминации последовательностей, влияющих на транскрипцию или процессинг РНК, — таких, как промоторы или сигналы полиаденилирования. Добавочные кодоны AUG выше предполагаемой точки начала трансляции также нежелательны, так [c.286]

Недавно был получен вектор, с помощью которого можно конструировать искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) [9]. Это открытие сулит переворот в картировании появляется возможность клонировать фрагменты ДНК, на порядок превышающие по размерам космидные вставки. Вероятно также, что соответствующие геномные библиотеки окажутся более представительными. Метод отпечатков пальцев (фингерпринт) пока пригоден лишь для маленьких YA , но, используя гибридизацию, можно будет присоединять к космидам и большие фрагменты. Скорее всего в будущем для картирования генома будет применяться техника подбора пар, специально разработанная для YA . [c.33]

Роль амплификации последовательностей ДНК в эволюции генома. Сходные последовательности в пределах одного генома в принципе могут возникать как независимо, так и при копировании исходной уникальной последовательности ДНК-после-довательности- родоначальника . Вероятность того, что две сходные последовательности возникли независимо, тем меньше, чем больше их сходство и длина. Нет сомнений, что именно увеличение числа предковых последовательностей привело к появлению семейств сходных последовательностей, которые составляют значительную часть современных геномов. Увеличение числа копий сегментов ДНК в ходе эволюции или в процессе эксперимента называется амплификацией. За амплификацию последовательностей в составе кластеров или последовательностей, рассеянных по новым геномным локусам, отвечают разные механизмы (гл. 10). Если основная последовательность удовлетворяет физиологические потребности организма, то образование дополнительных ее копий в геноме не приводит к особым преимуществам- подразумевается, что все эти копии, кроме одной, не содержат мутаций, включая нуклеотидные замены, делеции и вставки. Одна измененная копия может быть нефункциональной или выполнять какие-то новые функции либо служить регуляторным элементом. Если такие измененные последовательности окажутся полезными, то они сохранятся под давлением отбора. В противном случае эти последовательности следует отнести к псевдогенам. Таким образом, амплификация ДНК создает основу для эволюции. [c.159]

Некоторые сегменты ДНК обладают способностью перемещаться в другие геномные локусы, иногда существенно изменяя экспрессию соседних генов. Такой эффект наблюдается, например, при встраивании мобильного сегмента в новый геномный локус, сопровождающемся изменением кодирующего участка или важного регуляторного элемента. В простейшем случае ген перестает экспрессироваться. Но нередко сами мобильные элементы содержат регуляторные элементы. В таких случаях экспрессия генов, соседствующих со вставкой, может претерпевать сложные изменения, в том числе с переходом на новые способы регуляции. [c.227]

Приготовить библиотеку геномной ДНК мыши, несущей ретровирусную вставку. Использовать рестриктазу, разрезающую ДНК вне ретровирусных последовательностей. [c.497]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

Чтобы идентифицировать полиморфные STR-локусы, нужно прежде всего провести скрининг геномной библиотеки человека, содержащей вставки небольшого размера (примерно 1000 п. н.), используя подходящий олигонуклеотидный зонд. Для идентификации клонированных (СА),,-повторов обычно используют зонд, состоящий из 15 СА-элементов. Каждую позитивную вставку секвенируют, чтобы установить длину СА-повтора и нуклеотидные последовательности фланкирующих его участков. Чтобы определить, являются ли фланкирующие последовательности однокопийны- [c.454]

При построении физических карт тех или иных районов хромосом или целых хромосом из геномных библиотек, содержащих крупные вставки (YA -, ВАС- или РАС-библиотек), наиболее приемлем метод картирования, основанный на использовании STS. STS — это короткий одно-копийный участок ДНК (примерно 100-300 п. п.), который можно вьшвить при помощи ПЦР с использованием уникального набора праймеров. Для получения протяженного контига, охватывающего значительный участок хромосомы, требуется большое число STS, находящихся на расстоянии 50-100 т. п. н. друг от друга. Напри- [c.462]

МУТАЦИЯ, наследуемое изменение генотипа. Различают точечные М. и крупные перестройки ДНК. К точечным относятся замены одиночных пар оснований ДНК (транзи-ции — замены одного пурина на другой и одного пиримидина на другой, трансверсии — замены пурина на пиримидин и наоборот) и выпадения или вставки одиночных нуклеотидных пар ДНК (мутации со сдвигом рамки считывания). Замена пары оснований может приводить к изменению кодона и послед, замене аминокислоты в кодируемом белке (миссенс-мутация) или же к образованию бессмысленного кодона и прекращению трансляции данной матричной РНК (нонсенс-мутация). К крупным перестройкам ДНК относятся делении (выпадения), дупликации (удвоения), инверсии (повороты на 180°), транслокации (перемещения) участков ДНК, а также инсерции (встраивания) новых сегментов ДНК. Иногда к М. относят изменения числа хромосом в клетке (геномная М.). Различают спонтанные М., возникающие с частотой 10 —10 (отношение числа мутировавших нуклеотидных звеньев к общему числу мономерных звеньев ДНК), и индуцированные, частота к-рых может пре-вьипат . 10 М. могут быть индуцированы хим. (дезаминирующие, алкилирующие и др. реагенты), физ. (ионизирующие излучения) и биол. мигрирующие генетические элементы) мутагенными факторами. Частота и специфичность возникновения спонтанных и индуцированных М. находятся под генетич. контролем. [c.356]

Учитывая возможные осложнния, связанные со сплайсингом, кДНК-вставки (если они доступны) предпочтительны по сравнению с последовательностями, содержащими интроны. Хотя ретровирусные векторы обладают способностью точно удалять интроны из геномных последовательностей и таким образом генерировать кДНК-копии клонированных генов, этот процеса не всегда достаточно эффективен [14]. [c.287]

Рис. 2 дает представление о размерах хромосомных сегментов, в пределах которых работают различные современные методы генетических исследований. Ось ординат представляет собой логарифмическую шкалу физических расстояний, измеренных в парах (или в тысячах пар) нуклеотидов (п.н. или т.п.н,). На шкале приведены и значения генетических расстояний, измеряемые в сантиморганидах (сМ). 1 сМ приблизительно равна 10 п. н. Однако это соотношение нельзя считать универсальным, ибо зависимость между генетическим и физическим расстоянием на хромосоме имеет нелинейный характер, на нее могут оказывать влияние горячие точки рекомбинации. Наличие таких областей может привести к ситуации, когда сравнительно большому генетическому расстоянию соответствует небольшой отрезок на физической карте. В то же время в геноме существуют участки, рекомбинация в которых маловероятна, а это приводит к обратной ситуации. Как показано на рис. 2, классические методы молекулярной генетики хорошо работают на последовательностях длиной до 50 г. п. н., что соответствует максимальному размеру вставки в космидный вектор. Участки большей длины можно клонировать путем прогулки по хромосоме , когда, используя уже клонированные последовательности, геномную библиотеку скринируют с целью получения перекрывающихся клонов. Таким способом удаётся анализировать последовательности длиной до нескольких сотен т. п. н. Однако, в [c.96]

Лигируйте геномную вставку с молярным избытком вектора (4 1), чтобы уменьшить число клонов со множественными вставками. Эти клоны, в принципе, не мешают в работе, так как легко выявляются благодаря такому отличительному признаку, как наличие в них двух соНЬфрагментов. [c.109]

В случае же использования вирР-г на с дополнительными вставками редко встречающихся сайтов рестрикции (см. рис. 6) разделение половинок фрагмента, составляющего прыжок, упрощается, и зонды можно получать непосредственно из ми нилизата фаговой ДНК. После того как установлено что фрагмент- пры-жок представлен в геноме единичной копией, надо провести его гибридизацию с блотом геномной ДНК из гибридных соматических клеток, чтобы убедиться, что прыжок осуществлен в пределах нужной хромосомы. Это очень важный момент, так как при создании геномной библиотеки всегда существует опасность нециклического лигирования. [c.113]

Рестрицированную ДНК экстрагируйте фенолом и переосадите. Затем лигируйте ее с плечами Я-вектора. Поскольку большая часть геномной ДНК останется в виде циклических молекул, для создания десятикратного молярного избытка концевых фрагментов вектора по сравнению с клонируемой вставкой потребуется очень незначительное количество вектора. [c.118]

Рассказывая о клонировании фрагмента ДНК, мы подразумевали, что нам доступен искомый ген или известна молекулярная масса фрагмента, который можно извлечь из электрофореграммы рестриктов ДНК. В действительности для получения нужного гена чаще всего необходимы поиски, и порой достаточно сложные. Для этого геномную ДНК, разрезанную выбранной рестриктазой, смешивают с ДНК вектора, вскрытого той же рестриктазой по уникальному сайту. В результате взаимодействия липких концов и последующего лигирования получают смесь рекомбинантных ДНК. После этого полученные плазмиды со вставками различных участков ДНК необходимо расклонировать. [c.275]

Устойчивые к антибиотикам клоны Е. соИ, содержащие плазмиды с вирусоспецифическими вставками, можно идентифицировать методом гибридизации на фильтрах по Грюнштей-ну — Хогнессу [33], используя в качестве зонда меченные з2р нефракционированные вирусные мРНК. После этого плазмиды, содержащие копии индивидуальных фрагментов, можно идентифицировать гибридизацией с меченными фрагментами геномной РНК. Описание стандартных методов клонирования можно найти в руководстве [34]. [c.220]

Наиболее распространенная причина появления ПДРФ — точечные мутации, делеции, вставки и инверсии, приводящие к исчезновению одних и образованию других сайтов рестрикции. В итоге гомологичные геномные фрагменты, образующиеся при гидролизе ДНК соответствующими рестриктазами, будут иметь разную длину. Разницу в длинах рестриктов можно выявить на электрофореграммах с помощью гибридизационньгх зондов блотингом по Саузерну (см. прило- [c.294]

Секвенирование клеточных геномов. Разработка автоматических секвенаторов существенно ускорила ироцесс анализа последовательностей и позволила приступить к секвенированию клеточных геномов, для которых предварительно составляют физические карты. Как правило, секвенируют по отдельности фрагменты геномной ДНК размером 40—200 т.п.н., клонированные с помошью космид, A-векторов, а также векторов типа YA , ВАС или РАС (см. с. 271). Для этого ДНК каждой вставки дробят случайным образом и субклоны секвенируют наугад. Далее составляют контиги, объединение которых завершает анализ фрагмента. Последовательная привязка фрагментов к физической карте генома позволяет контролировать процесс его секвенирования. Уже известна полная нуклеотидная последовательность нескольких клеточных геномов [c.309]

Сложные Ds-вставки в гене сахарозосинтазы Sh) кукурузы. Структуру мутантного (Sh ) и ревертантного (Sh ) локусов определяли с помощью клонированных сегментов геномной ДНК. У мутанта Sh данный ген прерывается инвертированными дупликациями Ds-зле-мента, которые окружают какой-то неохарактеризован-ный сегмент ДНК, отличный от Ds. Участок длиной более 20 т. п. н. на 5 -конце гена дуплицирован он состоит из части гена и части сложной вставки. У -ревертанта вставка утрачена, но дупликация на [c.248]

Транспозиция IAP и их мутагенное действие. 1АР-элементы, перемещаясь в новые геномные сайты, вызывают мутации как в клетках зародышевой линии, так и в соматических клетках. Например, из клеток сверхпродуцентов легких цепей иммуноглобулинов были получены мутантные клеточные линии, вообще не продуцирующие этих цепей, и в некоторых из них в интроны гена легкой цепи были встроены 1АР-элементы. При этом 1АР-элемент мог находиться в любой ориентации относительно направления транскрипции иммуноглобулинового гена. Известен и еще один пример. Встраивание 1АР-элемента приводит к повышению уровня экспрессии соседнего с ним гена-явление, типичное для многих транспозирующихся элементов. Так, 1АР-элемент, встроенный в 5 -половину кодирующей области мышиного онкогена -mos, вызывает ускорение транскрипции последовательностей -mos, расположенных в З -направлении от вставки, при этом, как и Ту-элемент, 1АР встраивается таким образом, что транскрибируется в противоположном направлении от последовательностей -mos. Анализ аберрантных транскриптов с использованием нуклеазы S1 наводит на мысль, что LTR-L содержит дополнительный контролирующий элемент, который ускоряет транскрипцию в направлении от 1АР-элемента. Наличие двунаправленных промоторов и энхансера в LTR-L было прямо показано в опытах с использованием специально сконструированных векторов. [c.259]

Смотреть страницы где упоминается термин Вставки геномной ДНК: [c.277] [c.319] [c.225] [c.356] [c.225] [c.428] [c.469] [c.473] [c.335] [c.283] [c.116] [c.116] [c.23] [c.96] [c.271] [c.272] [c.275] [c.277] [c.359] [c.195] [c.223] [c.245] [c.266]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология