Антигены введение метки

Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах ИФА. Эти методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда. [c.115]

Третий метод состоит в приготовлении моноклональных антител, меченных ферментом или радиоизотопом, и определении возможности меченых и немеченых моноклональных антител конкурировать за одни и те же центры связывания на антигене. Этот метод обладает высокой точностью, однако требует введения метки в каждый вид антител и оценки конкуренции для каждой пары. Этот метод не применяется, если необходимо проанализировать моноклональные антитела большого количества гибридом. Необходимо иметь в виду, что на ранних стадиях получения гибридом количество имеющихся в наличии моноклональных антител ограничено. Это делает невозможным их отбор рассматриваемым методом. [c.174]

Гель-электрофорез. Электрофорез на геле и крахмале применяют для аналитических целей. Наиболее важным применением гель-электрофореза является иммуноэлектрофорез. Для этого вида анализа используют макропористые гели, в частности гели агара и агарозы. Метод иммуноэлектрофореза основан на том, что после разделения электрофорезом происходит диффузия разделенных веществ — антигенов — в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. Навстречу этим соединениям диффундируют антитела. При соединении антигенов и антител образуются характерные дуги осаждения. Метод иммуноэлектрофореза очень чувствителен при обнаружении антигенов, специфических для данных антител. В настоящее время применяют метод введения радиоактивной метки в антигены, благодаря чему радиоиммуноэлектрофорез является одним из самых чувствительных методов анализа биополимеров. [c.364]

Существуют три основных методических подхода для решения этой задачи. Первый способ — избирательное окрашивание нейронов, выделяющих определенный нейромедиатор, может осуществляться с помощью преобразования естественного медиатора в его флуоресцирующее производное. В этом случае флуоресценция определенных групп клеток поможет выявить специфические связи в структурах мозга. Второй экспериментальный подход связан с введением молекул медиатора, предварительно меченного радиоактивным изотопом. Нейронные окончания, содержащие исследуемый медиатор, способны избирательно захватывать метку. Затем их легко выявить методом авторадиографии. Третий способ обнаружения специфических связей в нервной системе состоит в использовании высоко специфичной способности узнавать либо антигенные детерминанты медиатора, либо определенные ферментные белки, участвующие в метаболизме нейромедиаторов, либо нейрорецептор-ные компоненты на мембране клетки. Последние считаются наиболее убедительным свидетельством в пользу существования конкретных нейрохимических взаимодействий межцу клетками и зонами мозга. Обычно для иммунохимической идентификации используют флуоресцентный краситель или изотоп, который маркирует антитела. В последние годы широко распространились методы, использующие антитела, меченные частицами тяжелых металлов, например коллоидного золота, железа и др. [c.224]

Особую значимость для широкого внедрения твердофазного ИФА в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полисти-рольных плат, содержащих 96 лунок. Факт сорбции антител на поверхности полистирола был установлен в середине 60-х годов и использован первоначально в методах РИА. Введение в практику ИФА полистирольных плат позволило значительно увеличить число-проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок платы. [c.7]

Метод является усложненным вариантом обычного двухцентрового или сэндвич -анализа, в котором образование комплекса детектируется не непосредственно введением в него меченного ферментом антитела, а с помощью содержащих ферментативную метку антивидовых антител. В качестве антивидовых (или вторичных) используют антитела, специфичные к глобулинам тех видов животных или птиц, которых иммунизировали антигеном для получения антисыворотки. Примером наиболее распространенных антивидовых конъюгатов являются меченные ферментом антитела кролика против иммуноглобулинов человека, меченые антитела козы (осла, барана и т. д.) против иммуноглобулинов кролика и т. д. [c.89]

Основной проблемой, стоящей особенно остро при введении ферментной метки в низкомолекулярные соединения, является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченых гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок — гаптен для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен — фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченых гаптенов является доступность очищенного антигена в значи-гельном количестве, что осуществимо далеко не всегда. [c.100]

В зависимости от структуры и молекулярной массы антигена при введении ферментной метки его константа связывания с антителами может увеличиваться, уменьшаться или оставаться неизменной. Увеличение эффективного значения константы связывания может быть обусловлено образованием в результате химической модификации олигомеров меченого антигена, формирующих при взаимодействии с антителами сложные по составу комплексы. Уменьшение сродства молсет наблюдаться при экранировании ферментом части антигенных детерминант либо в результате кон-формационных изменений, возникающих из-за образования ковалентных связей. [c.230]

С другой стороны, анализ на1эснове меченых антигенов сопряжен с рядом сложностей. Разнообразие строения и физико-химических свойств антигенов препятствует созданию универсальных методов получения антигенферментных конъюгатов. Схема введения метки в один антиген часто оказывается неприемлемой при переходе к другому. По существу, синтез большинства конъюгатов антигенов с ферментами представляет собой самостоятельную задачу, сложность которой возрастает по мере уменьшения молекулярной массы и растворимости антигена. [c.100]

Наиболее простым и чувствительным способом выявления антител, способных одновременно связываться с антигеном, является тест на аддитивность связывания. Предварительная очистка и введение метки в моноклональные тела в этом случае не нужны. В основе метода лежит оцеНка числа антигенных центров, одновременно доступных для пары антител. Определение осуществляется методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Основным условием при этом является полное насыщение антигена обоими типами антител. Поэтому на первой стадии Эксперимента необходимо получить кривые насыщения антигена аСцитиой или культуральной жидкостью, содержащей анализируемые антитела, и затем определить максимальную оптическую плотность в иммуноферментном тесте, достигаемую при насыщении. [c.174]

Отсюда, при фиксированной концентрации антитела, равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена количественно связано с общей концентрацией лиганда. Это соотношение лежит в основе любого иммуноанализа. Таким образом, если ввести в анализируемую систему фиксированное количество меченого антигена, то можно определить и неизвестную концентрацию антигена. Неизвестную концентрацию антитела определяют при помощи меченых антител. Для введения метки в антитело или антиген можно использовать различные метящие агенты, такие, как радионуклиды, ферменты, красные кровяные клетки, флуоресцентные и хемилюминесцентные зонды или металлы. В радиоиммуноанализе (РИА) и иммуно-ферментном анализе (ИФА) метят антиген, а в иммунорадиометрическом (ИРМА) и иммуноферментометрическом (ИФМА) анализе - антитело. В большинстве методик иммунного анализа требуется порознь определять связанный и свободный меченый антиген или антитело. Поэтому эти методики довольно громоздки и длительны. [c.57]

Другой метод, не связанный с присутствием в белке остатков триптофана, тирозина и фенилаланина, состоит во введении в белок флуоресцирующей метки, например, с помощью флуо-ресцеинизотиоцианата или 5-диметиламинонафталинсульфохло-рида (ДНС-хлорида). Метод применялся для введения флуоресцентной метки в антитела [81, 82], которые затем использовали для обнаружения антигенов. [c.459]

Возможность применения ферментов в качестве метки в иммуно анализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитическо активностью, позволяющей с применением соответствующих суб стратных систем регистрировать ферменты в растворе на уррвн( 10-15 д ниже. Благодаря широкому развитию методов энзимоло ГИИ принципиально решена проблема введения ферментной метки I молекулы антигенов и антител, что позволяет в настоящий момент легко осуществить связывание молекул ферментов с другими соеди нениями с целью получения соответствующих конъюгатов. [c.78]

Многообразие методов гетерогенного анализа, относящихся к типам I и II, обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов—антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохимических комплексов от несвязавщихся компонентов. Поэтому принцип разделения гетерогенных методов может быть представлен схемой 4.3. [c.83]

Следующий метод нековалентного введения ферментной метки в гетерогенном ИФА антигенов и антигел основан на использовании авидина (основной гликопротеид, Л4г = 66000, компонент яичного белка) и биотина (витамин, Мг=22Ъ), образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 цто в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген — антитело. Один из вариантов ИФА антител с использованием этой техники может быть проведен по схеме (см. с. 106). [c.105]

Если весь процесс иммуноферментного анализа условно разделить на три основные стадии - формирование специфического комплекса антиген — антитело (иммунохимический процесс), введение в него метки и ее визуализация тем или иным физическим способом, то можно заметить, что основное внимание в данной книге фокусируется на второй и третьей стадиях, представляющих преимущественно энзимологический аспект проблемы. В книге рассмотрены практически все известные способы регуляции активности ферментов, как химические (с помощью активаторов, ингибиторов, субстратов, простетических групп), так и физические (путем изменения активности ферментов при образовании комплекса антиген — антитело, с помощью ультразвука, конформационных и диффузионных ограничений). Главное достоинство монографии состоит в том, что в ней, по-видимому, впервые комплексно рассмотрены возможности регуляции активности ферментов, которые могут быть использованы для создания методов иммуноферментного анализа. В этом смысле оправдано английское название книги Enzyme-mediated immunoassay , которое буквально переводится, как Иммунный анализ, опосредованный через ферменты . [c.5]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология