Титрование ферментов

Результаты измерения w ацетилхолинэстеразы угря двумя вариантами кинетического метода Уилсона и Гарриса и методом титрования дают удовлетворительное совпадение, что свидетельствует о достаточной надежности обоих методов. Следует заметить, что метод титрования фермента специфическим необратимым ингиби- [c.173]

При титровании фермента спин-меченым аналогом измеряют снижение амплитуды в спектре электронного парамагнитного резонанса. [c.408]

Метод титрования активных центров, основанный на измерении начального всплеска, отличается от метода определения скорости ферментативной реакции тем, что он относительно нечувствителен к изменениям констант скорости. Для того чтобы получить воспроизводимые значения скорости ферментативной реакции, необходимо поддерживать строго определенные значения pH, температуры, концентраций компонентов буфера и т. д. В то же время при относительно больших изменениях константы к 2 вызываемых, например, химической модификацией фермента, величина начального всплеска остается неизменной, если только к 2 не уменьшается настолько, что ее уже не удается измерить. Таким образом, химическая модификация либо совсем не влияет на значение молярной концентрации фермента, получаемое описанным методом, либо вызывает снижение его до нуля. По этой причине метод титрования фермента был назван испытанием но принципу все или ничего [99]. [c.221]

Детальное изучение адсорбции различных ферментов на КМ-целлюлозе в присутствии субстрата и без него показало, что в некоторых случаях наблюдаемый эффект был больше ожидаемого в присутствии лиганда кривые зависимости а от pH были сдвинуты в сторону более низких значений pH [38]. При фиксированном значении а можно подсчитать общий заряд фермента и комплекса фермент — субстрат, используя два значения pH, соответствующих величинам а на кривых титрования. Для некоторых ферментов было установлено, что указанный сдвиг целиком обусловлен изменением заряда, происходящим при титровании фермента в этой области pH. Например, кривая зависимости а от pH для пируваткиназы из мышц кролика в присутствии 0,1 мМ фосфоенолпирувата сдвигается только на [c.137]

В процессе титрования фермента 18% флуоресценции тушится, а величина рК, связанная с этим тушением, представляет со бой р/С гистидина. Следовательно, поблизости от одного из триптофановых остатков должен быть гистидин (правило 7). Если фермент титровать после связывания субстрата, Q не меняется, т. е. в присутствии субстрата гистидин не может быть оттитрован. Отсюда в месте связывания содержатся как гистидин, так и триптофан, и субстрат может связываться непосредственно с гистидином. [c.426]

Для количественного анализа взаимодействия проводят другой эксперимент, в котором определяют максимальный прирост интенсивности флуоресценции зонда при его полном связывании с белком. При этом постоянную низкую концентрацию аурамина О (которую выбирают таким образом, чтобы можно было зарегистрировать флуоресценцию зонда в буфере) титруют нарастающими количествами фермента. Строят график двойных обратных величин и проводят экстраполяцию к бесконечной концентрации белка. Таким образом устанавливают значение интенсивности флуоресценции данной концентрации зонда при его полном связывании с ЛДГ. Соотношение полученной величины с флуоресценцией данной концентрации зонда в буфере показывает, во сколько раз увеличивается флуоресценция аурамина О при связывании. Используют несколько концентраций аурамина О для титрования белком, что повышает точность определения величины прироста флуоресценции (Фтах). В этих экспериментах [c.342]

Для иммобилизованных ферментов наряду с определением содержания связанного белка, общей или относительной активности дополнительную ценную информацию может дать также титрование активных центров. Примеры приведены в разд. 9.4. Некоторые методики для наблюдения за конформационными изменениями даны в разд. 9.5, а методы исследования распределения белков, связанных на поверхности нерастворимого носителя,— в разд. 9.6. [c.236]

После связывания ферментов с нерастворимыми носителями их свойства могут меняться либо под влиянием микроокружения, либо в результате изменений, вызванных химической модификацией благодаря образованию новых ковалентных связей. Следовательно, очень полезно охарактеризовать фермент не только определением общей ферментативной активности и количества связанного белка, но и путем титрования активных центров. [c.250]

Преимущества этого метода перед другими состоят в следующем при его применении сохраняется постоянное значение pH и, следовательно, нет опасности изменения активности фермента вследствие изменений его ионизации метод сразу дает постоянную по большому числу точек кинетическую кривую, позволяющую рассчитывать необходимые кинетические константы ферментативной реакции метод позволяет измерять кинетику процесса практически при любых условиях расход времени на измерение скорости реакции весьма невелик при условиях нулевого порядка реакции обычно бывает достаточно проводить титрование в течение 3— 4 мин., зафиксировав 8—10 точек расхода щелочи метод может быть использован для исследования кинетики взаимодействия холинэстераз с ингибиторами. [c.149]

Вторым направлением развития метода потенциометрического титрования является создание способа поддержания в ходе ферментативной реакции постоянства концентрации субстрата в реакционной среде. Необходимость такого метода диктуется особенностями кинетики реакций, катализируемых ацетилхолинэстеразой и некоторыми другими ферментами, активность которых тормозится уже при сравнительно низких концентрациях субстрата. Прн изучении кинетики таких реакций во избежание субстратного торможения приходится работать в области концентраций, не достигающих насыщения фермента. С другой стороны, при высокой молекулярной активности фермента (как, например, в случае ацетилхолинэстеразы) это приводит к быстрому снижению концентрации субстрата и переходу из кинетической области нулевого порядка к мономолекулярной, что затрудняет вычисление начальной скорости реакции. [c.152]

Эти эффекты можно промоделировать с помощью изменения pH. При pH < 5 карбоксильные группы протонируются, а при pH > 9 аммонийные группы лизина в результате депротонирования начинают утрачивать свой положительный заряд. При экстремальных значениях pH это вызывает изменение кривых титрования фермента. Наиболее сильно такие эффекты проявля- [c.176]

Кинетика установления равновесия при взаимодействии а-химотрипсина с Ы-ацетил-Ь-триптофаном. Условия опыта pH 2,3 (цитратный буфер) 25° С ионная сила 0,0Ш [Р о = 5,9410- М. Концентрация свободного фермента определялась титрованием его -нитрофениловым эфиром N-aцeтил-L-тpиnтoфaнa [c.155]

Активность миозина в пробах рассчитывают в микромолях неорганического фосфата за 1 мин на 1 мг белка. Проводят сопоставление кривой титрования сульфгидрильных групп миозина ПХМБ и кривой изменения его активности при разной степени модификации. Отмечают полную потерю активности ферментом при 100%-ном блокировании SH-rpynn, а также 1,5—3-кратную активацию АТФазы при блокировании до 50% SH-rpynn. [c.399]

Расхождение между результатами титрования контрольного и пытного растворов должно составлять 0,5—6,0 мл 0,1 н. раствора носульфата. Если расхождение меньше 0,5 или больше 6 мл, то нализ повторяют с большим или меньшим количеством фермент- го раствора. [c.291]

Из данных кислотного гидролиза ясен общий состав кофермента. Щелочной гидролиз говорит о том, что одна половина фермента состоит из остатка аденозин-5-фосфата. Выделение рибофлавина (строение которого уже было известно) и его 5-фосфата демонстрирует структуру второй половины молекулы. Единственным нерещенным вопросом остается вопрос о связи этих двух половин молекулы кофермента между собою. Поскольку при титровании ФАД было показано, что он содержит два первичных кислотных гидроксила, то ясно, что обе фосфатных группировки связаны с двумя радикалами, и, следовательно, они могут представлять только пирофосфатную систему, из чего для ФАД следует строение (ХУП1), подтвержденное позднее полным синтезом. [c.237]

Эта реакция, аналогично параллельно протекающей реакции, описанной 1В гл. 4 [уравнение (4-31)], которая приводит к образованию желтой нестабильной формы тиамин-аниона, является примером практически полностью кооперативного отщепления двух протонов, сопровождающегося структурными изменениями. В ходе титрования не обнаружено сколько-нибудь значительных концентраций промежуточного соединения. Это свойство необычно для небольших молекул, и оио помогло Вильямсу и др. правильно установить строение витамина. Имеют ли эти реакции какое-либо биологическое значение Тиольиая форма, представленная выше, или желтая форма [уравнение (4-31)], могла бы присоединяться к активным центрам белков с помощью дисульфидных связей. Одиако если такие реакции ферментов с тиамином и происходят, то пока они еще ие обнаружены. [c.208]

Титрование показывает, что соединение I превращается в соединение 1Г одноэлектронным восстановлением, а соединение И превращается в свободную пероксидазу другим одноэлектронным восстановлением (например, с использованием ферроциадида). Таким образом, железо в соединении I может быть формально представлено как Ре(У), а в соединении II — как Ре(1У). Однако это мало что нам говорит о судьбе НгОг-в реакции с ферментом, когда образуются соединения I и П. Присутствуют ли атомы кислорода Н2О2 в соединениях I и II или иет По этому поводу развернулись горячие дебаты, но окончательный ответ так и яе- [c.377]

Определение кислотности казеина имеет большое значение для> установления качества продукта. Кислотность в нем создается продуктами распада и есть результат действия главным образом ферментов. Для установления количества этих продуктов можно пользоваться различной методикой. Для этой цели годна нефелометрия, методы определения аминного азота, определение сухого остатка в вытяжке, определение числа основности путем титрования кислотой. По стандарту установлен метод определения числа Тернера, но описание методики в стандарте усложнено и пропущена одна важная деталь. Усложнение касается промывки на фильтре с доведением общего объема фильтрата до 200 см . Стандарт, вводя промывку фильтра, стремится как бы к более тщательному извлечению веществ, определяющих кислотность, а на деле путем разбавления фильтрата и оставления без учета воды, оставшейся на фильтре, только снижает полученный результат и усложняет операцию. Коллоидный раствор фильтруется крайне медленно, и в силу большего коэфициента (80), на который множится полученный результат, ошибка опыта увеличивается. Серьезная деталь, пропущенная в стандарте, касается необходимости определенным образом измельчать казеин. Когда при определении кислотности из казеина извлекаются коллоиды, необходимо Считаться с поверхностью исследуемого продукта, так как извлечение касается только поверхнссти. Ниже приводятся цифры градусов Тернера, полученные при анализе одного и того же казеина, но различной степени измельчания [c.105]

Пример расчета. Для определения суммарной активности ферментов была взята навеска муки (5,39 г) и приготовлено 100 мл болтушки. Из данного объема отобрано 5 мл фильтрата, который дополнительно разбавлен еще до 100 мл. Из последнего раствора для опыта взято 5 мл, что соответствует количеству ферментов, содержащихся в 0,0135 г муки. На титрование в рабочем опыте (среднее из двух определений) пошло 17,85 мл 0,05 н. раствора КМПО4 с поправкой 0,9789, в контрольном — 0,69 мл. Количество восстановленной меди вычисляют по формуле (см. Определение активности сахарозы ) [c.99]

В процессе титрования белка от предельно кислой до предельно основной формы должно существовать такое значение pH, при котором суммарный заряд белка равен нулю. Это значение pH носит название изоэлектрическая точка (р[). При значении pH, равном изоэлектрической точке, белок максимально инертен, не перемещается в электрическом поле и имеет наиболее тонкую гидратную оболочку. Большинство белков имеют изоэлектрическую точку при нейтральных или близких к ним значениях pH, однако есть ряд исключений, например, для фермента желудочного сока пепсина р/ = 1,4, а для фермента рибонуклеазы — 10,5. Если в белковом растворе нет никаких ионов, кроме ионизированных аминокислотных остатков, то такие растворы называются изоионньши. [c.52]

Имеется сообщение [15] об исключительно чувствительной и специфической методике для определения групп —8Н, по которой в качестве титрующего агента используется Ag (Tris)" , где Tris обозначен три(оксиметил)аминоэтан. Титрование можно проводить в водных буферных нейтральных растворах, которые не денатурируют белки и не ускоряют скорость окисления групп —SH. Титрующие смеси с pH 7,4 готовят смешением 4 мл М. раствора три(оксиметил)аминоэтана с 3,4 мл 1 М HNO3 и 0,3 мл 1 М раствора КС1. После добавления необходимого количества тиола (около 1 мкМ) раствор доводят до 30 мл и титруют, используя насыщенный электрод Hg — HgO — Ва(0Н)2, который имеет потенциал —0,10 в относительно НКЭ. При титровании небелковых групп —SH в присутствии 0,01% желатины получают более воспроизводимые отсчеты тока. Этот метод дает сведения как о числе, так и об относительной реакционной способности групп —SH в таких нативных и денатурированных белках, как альбумины, ферменты и гемоглобины. [c.392]

Перед титрованием активных центров останавливают насос, вводят в систему реактор, содержащий фермент, включают насос с медленной скоростью, переворачивают реактор на короткое время, чтобы удалить из него воздух, и, наконец, повышают скорость циркуляции до 10 мл/мин. На рис. 9.4 показано увеличение светопоглощения в результате выброса и последующий после выброса гидролиз, записанные на диаграммной ленте самописца. Расгвор содержит большой избыток НФГБ относительно стехиометрического количества наблюдаемые на начальном участке диаграммы колебания объясняются небольшой пробкой п-нитрофенола в результате быстрой реакции приблизительно стехиометрического объема раствора титранта с ферментом, когда этот раствор проходит через реактор. Осцилляции быстро демпфируются, когда пробка разбивается , и концентрация -нитрофенола во всей системе становится постоянной. Выброс определяется путем простой экстраполяции начальной и последующей кинетических кривых гидролиза к началу контакта фермента и титранта. [c.251]

Титрование активного центра химотрипсина, ковалентно связанного с сефадексом 0-200, описано Гейблом [25], который в качестве титрующего агента использовал 4-метилумбеллифернл-п-(К, Ы-триметиламмоний)циннамат (МУТМАЦ). Этот флуорогенный титрующий активные центры реагент позволяет определять даже 0,02 нмоль фермента. [c.252]

Комплексы, образуемые перекисью водорода с гемопротеинами, изучены более подробно, сначала методом визуальной спектроскопии, а в более поздних работах путем применения специальной техники быстрой спектрофотометрии. Все эти комплексы настолько неустойчивы, что их не удалось выделить. Показано, что и пероксидаза и каталаза образуют по три комплекса, тогда как метгемоглобин и метмиоглобип—только по одному. Эти комплексы различаются по цвету и Чанс [375] и Джордж [367] в составленных ими обзорах описали эти различия. Чанс характеризует эти комплексы как первичные, вторичные и т. д. в соответствии с характером спектров. Некоторые из этих комплексов принимают участие в ферментных реакциях. Проведено много работ для выяснения их относительных ролей. Чанс [375] указывает, что первичные комплексы наблюдаются лишь для гемопротеииов, активных как ферменты, тогда как каталитически неактивные гемоглобин и миоглобин их не образуют. Имеются также различия в константах равновесия при образовании и диссоциации обоих этих типов комплексов. С механизмом катализа при действии этих ферментов связано также то, что в отсутствие избытка перекиси водорода первичные комплексы, относительно говоря, устойчивы. Это дало возможность титрования гемопротеинов перекисью водорода с применением специальной техники такого рода исследования показали, что на каждый атом железа связывается одна молекула перекиси водорода. Ход этих реакций и форма образующихся комплексов еще не вполне выяснены. Чанс [375] и Джордж [c.352]

Поскольку в описываемом методе применяется титрование раствором щелочи, в ходе реакции происходит разбавление раствора, что Может изменить концентрации фермента и субстрата, а следовательно, и скорость процесса. Во избежание заметного влияния разбавления на скорость реакции объем прибавляемой щелочи необходимо свести до минимума. Это может быть достигнуто применением сравнительно концентрированных растворов NaOH, однако вводимых при помощи ультрамикробюретки. Так, например, при объеме реакционной смеси 3—5 мл, применение 0,1 н. раствора NaOH в общем объеме на титрование 10—15 мкл дает разбавление [c.150]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология