Экспрессия генов мутантных

Тесты на уровне ДНК позволяют безошибочно выявлять специфические мутации. Раньше для зтого применялись биохимические методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты не требуют экспрессии мутантного гена для его выявления, что позволяет разработать системы скрининга для всех моногенных заболеваний. [c.195]

Прежде чем обсуждать генетику бактерий, мы должны познакомиться с типами изучаемых мутаций и с используемыми для них обозначениями. Е. соИ дикого типа растет в лабораторных условиях на очень простой среде, единственным органическим составляющим которой служит источник углерода как правило это глюкоза. Штаммы дикого типа прототрофны (см. главу 4) они способны синтезировать любые сложные органические молекулы, необходимые для их метаболизма и роста. Эти биосинтетические способности (анаболические функции) требуют работы (экспрессии) многих существенных (т.е. необходимых для существования бактерий) генов. Многие мутации, нарушающие экспрессию необходимых биосинтетических функций, называются условно летальными (см. главу 7), поскольку бактерии с такими мутациями могут существовать только при добавлении в среду необходимых органических молекул. Такие мутанты называются ауксотрофами (т.е. требующими дополнительного питания). При изучении организации бактериальных генов мы будем рассматривать ауксотрофные мутации только в качестве генетических маркеров. Более подробно они будут обсуждаться в главе 10. Фенотип ауксотрофных бактерий обозначают латинскими буквами, указывающими соединение, которое необходимо добавлять в среду для их нормального роста. Например, Met , Thi и Pur обозначают, соответственно, мутантные штаммы, нуждающиеся в метионине, тиамине и пурине соответствующие прототрофные фенотипы (дикий тип) обозначаются символами Met, Thi и Pur. [c.228]

Другая система предоставляет возможность для выделения дискретных точек начала репликации. Клетки дрожжей S. erevisiae, мутантные по какой-то функции, могут быть трансформированы путем добавления ДНК, которая несет копию гена дикого типа. Схема эксперимента представлена на рис. 31.13. Мутация клетки-хозяина должна затрагивать ген, продукт которого можно селектировать. ДНК клеток дикого типа выделяют, фрагментируют и клонируют в составе плазмид Е. oli. Гибридные плазмиды инкубируют с мутантными клетками дрожжей в таких условиях, в которых эти клетки способны выжить только в случае экспрессии гена дикого типа. В зависимости от частоты возникновения трансформированных клеток различают два типа трансформации. [c.403]

Энхансер Р-глобина курицы расположен позади транскрипционной единицы Р-глобина. В последовательных поколениях эритроцитов (и только в них), он образует гиперчувствительный к нуклеазе сайт. Этот факт свидетельствует о том, что в эритроцитах с энхансером связаны белки-регуляторы. Для того чтобы ггдентифицировать их, следует определить, какая именно последовательность нуклеотидов необходима для проявления активности энхансера. Для этого мутантные последовательности энхансера объединяли с маркерным геном. Продукт такого гена легко определить это дает возможность судить о влиянии любой мутации энхансера на транскрипцию каждую рекомбинантную конструкцию вводили в эритроциты курицы и регистрировали эффективность экспрессии гена-маркера (рис 10-20). Те нуклеотиды, которые при таком тестировании оказываются необходимыми для активности энхансера, можно считать участками связывания специфических белков. С помогцью данной методики было установлено, что тагсих белков-три (рис. 10-21). Содержание каждого из них в клетке очень мало, но благодаря гому, что сайты их связывания известны, можно клонировать кодируюгпие последовательности ДНК и, следовательно, получать эти регуляторные белки в неограниченном количестве (см. разд. 9.1.7). [c.193]

За последнее десятилетие удалось осуществить молекулярное клонирование и характеризовать структуру множества генов млекопитающих. Функциональное содержание и механизмы регуляции этих генов исследуются теперь в экспериментах по переносу генетического материала. Рекомбинантные конструкции на основе последовательностей дикого типа или их мутантных производных вводят путем трансфекции в культивируемые клетки [I] для того, чтобы идентифицировать г ис-действующие регуляторные элементы и изучить физиологические последствия экспрессии генных продуктов. Однако,, даже если для интересующего гена и существует подходящая культивируемая тканевая система, возможности исследования генной экспрессии в таких экспериментах in vitro ограничены. В конце концов функции генов и закономерности их экспрессии следует изучать, исходя из сложности целого организма. Был разработан целый ряд методик, позволяющих вводить интересующие нас последовательности ДНК в клетки зародышевого пути мышей и других млекопитающих. Включившись в геном данного организма, такие чужеродные последовательности, называемые трансгенами, устойчиво наследуются в ряду поколений. Весьма важное значение имеет тот факт, что трансгены часто экспрессируются и вызывают изменения в системе тканевой специфичности, физиологических реакциях, а иногда во всей программе развития организма. Следовательно, открывается путь к изучению функциональной роли и регуляции экспрессии интересующих нас клонированных генов на уровне целого организма — в данном случае это так называемый трансгенный организм. [c.308]

Использование основных приемов работы с рекомбинантной ДНК и методик анализа белков и нуклеиновых кислот позволяет клонировать гены и изучать их организацию (блоттинг-гибридизация по Саузерну), строение мРНК (нозерн-блоттинг),. а также следить за уровнем экспрессии генов в различных условиях окружающей среды и даже в процессе развития. Например, в некоторых случаях уровни транскрипции гена определяют методом дот-блот-гибридизации выделенной РНК (разд., 6.3). Более подробные качественные исследования транскрипционной активности осуществляют с помощью нозерн-блоттинга (приложение 6 [I]). 5 - и З -концы транскриптов определяют, используя Sl-картирование [2, 56]. Однако такие методы анализа позволяют установить только строение транскрибируемой области или гена, а также механизмы процессинга транскриптов и их трансляции. Функцию любых участков вне транскрибируемой последовательности в некоторой степени можно изучать, сравнивая гены, обладающие сходными механизмами регуляции. При этом большинство предположений о воздействии на экспрессию гена остаются исключительно в области догадок. В этом случае генетическая трансформация предоставляет исследователю, работающему с растениями, уникальную-возможность непосредственно отвечать на фундаментальные вопросы, касающиеся регуляторной функции последовательностей, расположенных как в непосредственной близости, так и на некотором расстоянии от 5 - и З -концов транскрибируемого-гена. Используя разнообразные методы мутагенеза in vitro и технологию рекомбинантных ДНК, удается, модифгщировать клонированные гены и затем после введения мутантного гена-путем генетической трансформации обратно в растения анализировать влияние изменения этого гена на его экспрессию.. Подобные методики способствовали изучению нуклеотидных [c.307]

По влиянию на экспрессию генов мутации разделяют на две категории мутации типа замен пар оснований и типа сдвига рамки считывания (й-атезЫЛ). Последние представляют собой делеции или вставки нуклеотидов, число которых не кратно трем, что связано с триплетностью генетического кода. Первичную мутацию иногда называют прямой мутацией, а мутацию, восстанавливающую исходную структуру гена, - обратной мутацией, или реверсией. Возврат к исходному фенотипу у мутантного организма вследствие восстановления функции мутантного гена нередко происходит не за счет истинной реверсии, а вследствие мутации в другой части того же самого гена или даже другого неаллельного гена. В этом случае возвратную мутацию называют супрессорной. Молекулярно-генетические механизмы, благодаря которым происходит супрессия мутантного фенотипа, весьма разнообразны. [c.278]

Варианты системы Y2H. Разработан ряд вариантов основной дрожжевой дигибридной системы, использующихся для отбора мутантных белков, взаимодействие между которыми нарушается в результате мутаций. В системе, получившей название обратной Y2H, для отбора белков с нарушенным взаимодействием применяют GaI4 DBD и AD, а также ген-репортер URA3 в качестве контр-селектируемого маркера (рис. 50, а). В такой системе вначале подтверждают взаимодействие между исследуемыми белками, выращивая клетки в отсутствие урацила, а затем отбор веществ, нарушающих взаимодействие между белками, проводят в присутствии 5-F0A. Клетки выживают лишь в том случае, если исследуемые белки в результате внешнего воздействия перестают взаимодействовать друг с другом, и экспрессия гена URA3 прекращается. [c.362]

Второй новый подход к изучению детерминации и дифференцировки у млекопитающих основан на использовании трансгенных мыщей. Этот подход был разработан для определения временных и пространственных аспектов экспрессии генов и для постановки экспериментов по генной терапии (рис. IV. 15). Суть его состоит во встраивании инъецированных генов в цеспецифические, случайные сайты генома клетки-хозяина. Такое отсутствие специфичности может затруднить исследование генной экспрессии и генотерапии, однако даст преимущества при изучении морфогенеза. Случайное встраивание инъецированной ДНК в кодирующие или важные в регуляторном отнощении участки может привести к изменению экспрессии гена-мищени. В результате может синтезироваться мутантный генный продукт или вообще блокироваться экспрессия данного гена. Этот метод внесения мутаций аналогичен так называемому инсерционному мутагенезу, широко использующемуся в генетике прокариот, дрожжей, D. melanogaster и кукурузы. В последнем случае в качестве [c.368]

Рис. 10-23. Известные белки-регулятчзры, контролирующие экспрессию гена 3-глобина курицы в ходе нормального развития эритроцита. Здесь суммированы данные экспериментов, описанных на рис. 10-20 и 10-21 аналогичных опытов, проведенных с мутантными элементами, расположенными перед промотором, а также результаты анализа другого типа. А. Связывающие участки белков-регуляторов и их действие. Следует отметить, что энхансер у этого гена расположен за кодирующей последовательностью. Белки, не отмеченные + (активация) или — (подавление), по-видимому, не оказывают существенного влияния на транскрипцию, поскольку мутация их сайта связывания не сказывается на уровне транскрипции (см. рис. 10-21). Б. Относительные количества регуляторных белков на разных стадиях развития. Числами О, 1 и 2 обозначено отсутствие, промежуточный и высокий уровень транскрипции соответственно, по нелинейной шкале. Имеющиеся в настоящее время данные не дают точного объяснения, почему ген включается между 4 и 9 днями развития. (С любезного разрешения Gary Felsenield.)

Парадоксальность такого заключения по сравнению с обычной ситуацией, когда сплайсинг осуществляется только по левой и правой границам одного и того же интрона, наглядно проиллюстрирована на рис. 26.10. На рисунке сравнивается экспрессия иммуноглобулинового гена дикого типа с мутантным геном, у котррого в результате делеции была удалена область, включающая границу между экзоном VI и интроном 2. (Структура и экспрессия иммуноглобулиновых генов детально обсуждаются в гл. 39.) [c.325]

Из-за такого сходства сплайсинг осуществляется по мутантному сайту вместо нормального. Это имеет место у больных талассемией и при экспрессии клонированного гена в культуре клеток обезьяны или человека. Вплоть до 90% молекул предшественника РНК подвергается сплайсингу по мутантному сайту вместо нормального. В тех немногих случаях, когда сплайсинг происходит по нормальному сайту, это приводит к образованию активной Р-глобиновой мРНК, обнаруживаемой у больных. Мы не знаем, почему мутантный сайт используется с большей эффективностью возможно, это обусловлено тем, что он располагается ближе к левой границе интрона или вследствие некоторых особенностей конформации РНК. [c.328]

Вокмсжность вести селекцию на амплификацию гена очень удобна в целом ряде случаев. Облегчается клонирование генов, способных к амплификации, а также анализ их структуры в составе хроматина. Однако в данной главе мы ограничимся вопросами, касающимися использования феномена амплификации для осуществления избыточной экспрессии белковых продуктов. Идея заключается в том, что ко-амплификация всех последовательностей рекомбинантной конструкции при селекции на амплификацию генов-маркеров резко усиливает экспрессию любого клонированного в ее составе гена, причем повышение продукции интересующего белка часто оказывается пропорциональныхМ увеличению числа копий гена — по крайней мере до тех пор, пока не будет достигнут. максимально возможный уровень экспрессии. В экспериментах такого рода часто используется ген дигидрофолят-редуктазы в комбинации с мутантными клетками СНО, у которых нет эндогенного фермента. [c.241]

Экспрессия Japan-мутанта была оценена количественно с помощью радиоиммунотеста, и результаты представлены в табл. 15 вместе с обобщенными данными об его свойствах [7]. Мутантный НА полностью гликозилирован и, подобно белку штамма дикого типа [29], собран из субъединиц НА как тример. Уменьшение приблизительно на 3000 в его молекулярной массе согласуется со степенью делеции в его гене. Инфицированные мутантом клетки не проявляют функции связывания эритроцитов или рН-зависимо-го слияния клеток, так как А НА не может образовывать необходимый мостик между двойным. липидным слоем инфицированной [c.181]

Обычно летальная мутация приводит к гибели эмбриона на определенной стадии развития ( эффективная летальная фаза , Хадорн [696]). Это легко объяснить, предположив, что именно на этой стадии экспрессия мутантного гена необходима для дальнейшего развития. [c.169]

Помимо сигналпередающей функции, белки D3 ответственны за транспорт ТКР к клеточной поверхности. У мутантных клеток, в которых отсутствует синтез у-, 5- или е-цепей, экспрессия ТКР полностью подавлена, хотя внутриклеточный синтез этих рецепторов не нарушен. При мутациях гена -цепи выход ТКР иа клеточную поверхность происходит в меньшей степени по сравнению с нормой. [c.105]

Некоторые внегенные супрессорные мутации могут стимулировать экспрессию мутантных генов, т. е. частично компенсировать дефект поврежденного белка увеличением его количества. Кроме того, может активироваться альтернативный метаболический путь или же изменяться специфичность других белков, которые приобретают способность в большей или меньшей степени выполнять функцию поврежденного или отсутствующего [c.71]

Причины модификаций, очевидно, не сводятся только к механизмам репрессии и индукции ферментов. По-видимому, существуют и некоторые спонтанные нарушения в действии генов, которые могут быть причинами морфозов и фенокопий. Впервые попытку исследования таких случайных модификаций предпринял Б. Л. Астауров в 1927 г. Он исследовал открытую им мутацию tetraptera у D. melanogaster. Эта репрессивная мутация приводит к превращению галтер, или жужжалец, во вторую пару крыльев. Б. Л. Астауров обратил внимание на сильное варьирование в проявлении мутантного признака, даже в условиях постоянной среды и гомозиготности по исследуемой мутантной аллели. Признак tetraptera варьировал не только от особи к особи размер дополнительной пары крыльев был неодинаков, но наблюдалось различие в его проявлении на левой и правой сторонах тела дрозофилы. На основе полученных результатов Б. Л. Астауров сделал вывод о закономерной неустойчивости в действии гена, экспрессия которого может спонтанно варьировать, и, по-видимому, эта неустой- [c.447]

Присутствие внутриядерного Т-антигена можно легко выявить иммунофлуоресцентным окрашиванием. С помощью этого метода можно, в частности, определить долю инфицированных клеток в культуре, которая отражает титр вирусной заготовки. Данный метод можно использовать и в экспериментах по трансфекции, в которых переносу подвергается участок ДНК, содержащий ранние гены вируса, присоединенные к чужим или мутантным промоторам. В этих случаях экспрессия Т-антигена показывает эффективность функционирования встроенных промоторов. Фиксированные клетки обрабатывают вирусоспецифической противоопухолевой сывороткой. Сыворотку получают от хомяков, крыс или мышей, у которых развились опухоли в результате инъекции вируса или синген-ных трансформированных клеток. Вместо противоопухолевых поликлональных сывороток можно использовать моноклональ- [c.241]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология