Ауксотрофные мутанты бактерий

Одна из основных трудностей при прямом отборе состоит в выборе оптимальной концентрации селективного агента. Например, при отборе мутантов, устойчивых к различным антибиотикам, важно подобрать такую концентрацию антибиотика, которая полностью блокировала бы рост бактерий дикого типа, но в то же время позволяла бы развиваться устойчивым мутантам. Определение оптимальной концентрации методом проб п ошибок может потребовать много времени и сил. В первом примере, приведенном ниже, описан простой метод создания градиента концентрации какого-либо агента в чашке, который можно модифицировать для выявления различных типов мутантов, упоминавшихся выше. Во втором примере описывается простой метод бумажных дисков, используемый для индукции и прямого отбора ревертантов ауксотрофных мутантов. [c.29]

Перенос генетического материала путем прямого контакта между двумя клетками называется конъюгацией. Уже давно на основании морфологических данных предполагали, что и у бактерий может происходить своего рода спаривание однако только эксперименты с множественными мутантами бесспорно доказали, что и у бактерий возможна передача генетического материала при прямом межклеточном контакте. В 1946 г. Ледерберг и Татум провели решающий опыт с двумя мутантами Е. соИ К12, каждый из которых был ауксотрофным по двум различным аминокислотам (рис. 15.14). Один двойной мутант нуждался в аминокислотах А и В, но был способен синтезировать С и D (А В D ) другой мутант был ему комплементарен (А В" С D ). Эти мутанты не росли на минимальной питательной среде и не образовывали колоний. Однако если на ту же минимальную среду высевали смесь суспензий обоих мутантов, то колонии появлялись. Клетки этих колоний обладали наследственной способностью синтезировать все аминокислоты, т.е. принадлежали к типу A B D (были прото-трофными). Такие клетки возникали с частотой 1 10 это были генетические рекомбинанты-они объединяли в себе генетическую информацию двух реципрокно дефектных (взаимодополняющих) родительских клеток. Использование в качестве исходных штаммов множественных мутантов исключало возможность появления ревертантов, так как вероятность одновременной реверсии по двум генам составляет величину порядка 10 на генерацию. Необходимой предпосылкой рекомбинации служил прямой контакт родительских клеток. [c.456]

Биосинтез нуклеотидов у ауксотрофных бактерий, лишенных способности синтезировать определенные аминокислоты. Нормальные клетки Е. соИ синтезируют все аминокислоты, но некоторым ауксо-трофным мутантам, не способным к синтезу определенных аминокислот, для оптимального роста необходимо вводить эти аминокислоты в питательную среду. Аминокислоты нужны не только для синтеза белков некоторые из них требуются для биосинтеза других азотсодержащих клеточных компонентов. Допустим, у нас [c.679]

Пенициллиновый метод отбора (и разработанный позднее метод отпечатков —метод реплик, — который будет описан в гл. VI) позволил легко выделить огромное количество ауксотрофов Е. соН. Среди этих ауксотрофов были обнаружены бактерии, нуждающиеся для роста в пуринах, пиримидинах и в семнадцати из дв дцати стандартных аминокислот. Неизвестны ауксотрофные мутанты лишь для трех аминокислот, аланина, аспарагина и глутамина. [c.121]

Микробиологический синтез лизина. Белки семян зерновых культур (пшеницы, ячменя, кукурузы и др.) не сбалансированы по содержанию незаменимых аминокислот и прежде всего лизина. Поэтому для удовлетворения потребностей животноводства в нашей стране, как и в ряде других стран (Япония, США, Франция, Испания, Югославия), организовано крупнотоннажное производство этой незаменимой аминокислоты. В основу производства положены технологии с использованием одноступенчатого микробиологического синтеза, которые включают промышленное культивирование ауксотрофных мутантов бактерий из рода СотупеЬас1егшт, способных к сверхсинтезу этой аминокислоты. Обычно у диких штаммов, из которых получены ауксотрофные мутанты, сверхсинтеза лизина не наблюдается, так как у них действуют механизмы саморегуляции. В клетках бактерий аминокислота лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты через ряд промежуточных этапов, связанных с образованием полуальдегида аспарагиновой кислоты, дигидропиколино-вой кислоты и а,8-диаминопимелиновой кислоты, являющейся непосредственным предшественником лизина. Полуальдегид аспарагиновой кислоты является также одним из предшественников в синтезе аминокислот— треонина, метионина и изолейцина (схема I). [c.276]

Для перепечатывания реплик к чашке с питательным агаром, на котором растут небольшие колонии бактерий, прижимают стерильную бархатную подушечку, после чего ее используют для перепечатывания реплик в чашки с минимальной средой. Исходные колонии и колонии, образовавшиеся в чашках-репликах (с минимальной средой), сравнивают, после чего отбирают колонии ауксотрофов (которые не росли на минимальной среде). На втором этапе ауксотрофы можио тем же методом реплик перенести в чашки с минимальной средой, содержаш,ей различные питательные добавки (аминокислоты, пурины, пиримидины, витамины и т. д.). Отбор становится проще при предварительной обработке пенициллином (дополнение 7-Г) облученных клеток в минимальной среде. Пенициллин убивает растущие клетки, тогда как ауксотрофы, которые не растут на минимальной среде, выживают. В дальнейшем производят разрушение пенициллина, добавляя пенициллиназу (дополнение 7-Г). В результате этих операций процентное содержание ауксотрофных мутантов в суспензии значительно увеличивается [3]. [c.188]

Сейчас во всем мире в больших количествах получают глутаминовую кислоту или ее натриевую соль (около 100 ООО т в год), -лизин и метионин (по 50 000 т в год). Большую часть этого количества дает микробиологический синтез (за исключением получения метионина). Для биосинтеза используют ауксотрофные мутанты, т. е. бактерии, которые под влиянием мутагенных факторов (облучение, химическое воздействие и др.), утратили способность самостоятельно синтезировать какую-нибудь необходимую для роста и развития аминокислоту, например гомосерин, а с другой стороны, приобрели способность к сверхсинтезу другой аминокислоты. Это значит, что для роста и размножения таких бактерий в среде должны содержаться определенные аминокислоты — гомосерин, треонин или метионин и т. д. Очень часто этим мутантам необходим и биотин. Такие бактерии называют гомосериндефицитными или биотиндефицитными. В то же время эти мутанты обладают способностью в большом количе- [c.157]

Погибает большое число нрототрофных клеток, мутанты же, которые не способны расти на минимальной среде, выживают. Затем клетки отмывают от яда и засевают на чашки Петри, со-держаш,ие агар и минимальную среду с некоторой добавкой универсальной среды. На этой среде оставшиеся неубитыми клетки дикого типа образуют большие колонии, а мутанты растут медленнее и дают мелкие колонии. В результате обогащения мутантов с помощью пенициллина удается обнаружить события, происходящие с очень малой вероятностью, например порядка 10 . Найдя на поверхности агара ауксотрофные мутанты, мы можем провести детальный анализ их недостаточности, пересевая их на пластинки с промежуточными средами, как говорилось выше. Метод Ледерберга и Зиндера — весьма важное развитие приемов селекции бактерий. [c.297]

Для производства аминокислот бактерии стали использоваться с начала 50-х годов. Штаммы их постоянно улучшали генетическими методами, выделяя ауксотрофные мутанты и мутанты с измененными регуляторными свойствами. Чтобы обеспечить образование аминокислот в больших количествах, в любом случае необходимо изменить систему регуляции обмена. Для этого можно либо стимулировать потребление субстрата в некоторых путях биосинтеза и выделение аминокислот в среду [c.147]

Менее распространены одноступенчатые технолог получения триптофана на основе ауксотрофных мутантов бактерии Ba illus subtilis, осуществляемые по схеме, близкой к способу получения лизина. Длительность одноступенчатого процесса 48 ч, а концентрация триптофана в культуральной среде составляет 10 г/л. [c.49]

В целях промышленного получения незаменимой аминокислоты триптофана разработаны технологии на основе использования ауксотрофных мутантов бактерии Ba illus subtilis с нарушенным синтезом фенилаланина и тирозина. Все технологические процессы организованы примерно по такой же схеме, как и получение лизина с помощью мутантов коринебактерий. Ферментация длится 48 ч при 37 С, концентрация триптофана в культуральной жидкости достигает 10 г/л. После отделения культуральной жидкости от клеток бактерий она упаривается и высушивается при 110—120°С. Высушенный продукт называют кормовым концентратом триптофана (ККТ). [c.282]

Высокое сродство синтетаз к своим аминокислотам имеет важное значение для ауксотрофных мутантов бактерий, которые растут лишь в присутствии определенной аминокислоты. В ряде случаев было показано, что это объясняется мутацией в соответствуюш,ей синтетазе [621, 1390]. Мутация затрагивает центр связывания данной аминокислоты, в результате сродство фермента к данной аминокислоте уменьшается во много сотен раз, хотя его сродство к тРНК или АТР почти не меняется. Поэтому необходимо увеличить концентрацию данной аминокислоты, чтобы заставить фермент соединить ее со своей тРНК и обеспечить синтез белка. [c.35]

После воздействия, индуцирующего мутации, и многочасового роста бактериальную суспензию инкубируют в среде с глюкозой, но без азота. Это делается для того, чтобы дать возможность клеткам использовать оставшиеся растворимые соединения азота. Через несколько часов добавляют пенициллин и сульфат аммония и проводят инкубацию (на этот раз продолжительностью до 24 ч.). Прототрофные родительские клетки растут, и пенициллин их убивает, тогда как ауксотрофные мутанты, нуждающиеся в определенной аминокислоте, не растут, и это позволяет им уцелеть. Затем суспензию освобождают от пенициллина промыванием или добавлением пенициллиназы и высевают на агаризованную среду, содержащую аминокислоты. Среди вырастающих в таких условиях бактерий процент ауксотрофных клеток оказывается более высоким (помимо них растут также прототрофные клетки, выдержавшие обработку пенициллином). Если бактерии устойчивы к пенициллину, то с той же целью можно применить другие антибиотики (новобиоцин, циклосерин, колистин, канамицин). Для избирательного уничтожения растущих клеток используют и такое явление, как летальный синтез . [c.451]

Прямой отбор широко используется для получения ревертантов (бактерий с обратными мутациями) ауксотрофных мутантов. Ауксотрофы представляют особый класс условно летальных мутантов, не способных выживать без искусственной поддержки извне в виде добавления какого-нибудь соединения — участника обмена веществ (например, аминокислоты, витамина), которое они сами не в состоянии синтезировать. Если ауксотроф возник в результате мутации, связанной с заменой оснований, его можно ревертировать (вызвать обратную мутацию, возвращающую к исходному типу) воздействием соответствующего мутагена. Помимо истинных ревертантов может возникать множество фенотипических ревертантов , которые своим появлением обязаны мутациям в локусах, отличных от тех, которые ответственны за первоначальную мутацию Например, мутанты со сдвигом рамки часто могут ревертировать за счет вторичной компенсаторной мутации со сдвигом рамки, расположенной вблизи локуса первой мутации и восстанавливающей правильное считывание триплетов. Некоторые мутанты с заменой оснований могут ревертировать под действием вторичной мутации, происходящей в другом месте мутировавшего гена. Предполагается, что при этом вторичная мутация частично компенсирует первоначальную мутацию посредством взаимодействия аминокислот, кодируемых мутировавшими локусами гена и расположенных в двух измененных областях белковой молекулы. Мутанты с заменой оснований, в особенности [c.31]

Тем же самым методом, который использовался ранее при работе с нейроспорой, можно точно установить природу недостающего фактора роста у любого ауксотрофного мутантного штамма. Для этого образны клона ауксотрофных бактерий вносят в ряд пробирок с минимальной средой, в каждую из которых были добавлены различные предполагаемые факторы роста —аминокислоты, витамины, пурины или пиримидины. Вещество, добавление которого к минимальной среде оказывается необходимым и достаточным для роста бактерии, и есть то вещество, в котором нуждается для своего роста ауксотроф. Татум не смог идентифицировать точную природу фактора роста для всех выделенных им ауксотрофных мутантов. Однако он установил, что многие из полученных им ауксотро-фов Е. ali реагируют на добавление в минимальную среду лишь одного какого-нибудь фактора. Например, один из полученных им мутантов нуждался для роста только в треонине, другой — только в пролине, третий —только в триптофане, четвертый —только в тиамине, пятый — [c.120]

Эти свойства ауксотрофных мутантов Е. соИ явились дальнейшим подтверждением теории один ген — один фермент. Восстановление роста ауксотрофа при добавлении в среду какой-то одной аминокислоты, витамина или пурина свидетельствует о том, что мутация, приведшая к возникновению этого ауксотрофа из прототрофной бактерии дикого типа, связана лишь с каким-то одним геном бактерии, который контролирует один-единстЕенный фермент, катализирующий одну из стадий биосинтеза соответствующего фактора роста. [c.121]

Относительно быстрое выяснение путей биосинтеза аминокислот и других соединений стало возможным благодаря использованию аук-сотрофных мутантов грибов и особенно бактерий. Ауксотрофность многих мутантов обусловлена утратой способности к образованию какого-то фермента, участвующего в биосинтезе. Для роста мутанта нужен в этом случае конечный продукт того пути биосинтеза, который блокирован из-за выпадения функции фермента. Эти мутанты обладают еще [c.254]

Метод, использованный Татумом для выделения ауксотрофов, оказался очень сложным приходилось отбирать наугад и вновь высевать тысячи бактериальных колоний. Поэтому генетики бактерий обрадовались, когда в 1948 г. Дэвис и Ледерберг опубликовали одновременно метод, позволяющий проводить прямой отбор ауксотрофов. Предложенный ими метод основан на том, что антибиотик пенициллин убивает бактерии только в том случае, если они находятся в процессе роста. Пенициллин препятствует синтезу клеточной стенки бактерии. Поэтому бактерии, растущие в его присутствии, вырастают из своей оболочки и в конце концов лопаются. Для бактерий, которые в данный момент не растут и, следовательно, не образуют клеточной стенки, очевидно, не имеет значения, подавлен синтез их клеточной стенки пенициллином или нет. Поэтому, чтобы отобрать небольшую фракцию ауксотрофных мутантов среди всех выросших колоний, культуру бактерий инокулируют в минимальную среду, содержащую пенициллин. В этих услоьиях все содержащиеся в культуре прототрофы будут расти и, следовательно, погибнут от действия пенициллина. Но любой оказавшийся в этой культуре ауксотроф, который не может расти из-за отсутствия в минимальной среде необходимого ему фактора роста, при этом уцелеет. Когда большинство прототрофов бывает убито, пенициллин из культуральной среды удаляют, а нем ногие выжившие клетки высевают на агар с полной средой. В принципе (хотя, увы, это не всегда так) после обработки культуры пенициллином на агаре с полной средой должны появляться только такие колонии, которые образуются клонами ауксотрофов. После этого уже можно описанным ранее методом определять их потреб нссти в спеиифических факторах роста. [c.121]

Проходивший летом 1946 г. в Колд-Спринг-Харборе 11-й симпозиум по количественной биологии был посвящен Наследственности и изменчивости у микроорганизмов . Этот симпозиум стал памятным событием в истории молекулярной генетики, так как именно на этом симпозиуме было сделано сообщение о существовании пола у бактерий. (К этому вопросу мы вернемся в последующих главах.) Однако для участников симпозиума вопросом первостепенной важности были не эти совершенно неожиданные открытия, а несомненный триумф теории один ген —один фермент. Несколько докладчиков сообщили о своих исследованиях ауксотрофных мутантов у грибов и бактерий. Изложенные ими факты показывали, что рост большинства ауксотрофных мутантов действительно можно восстановить, добавляя к минимальной среде лишь один какой-нибудь метаболит. После одного из таких докладов выступил Макс Дельбрюк и указал, что, как ни убедительны на первый взгляд эти данные, они все же не доказывают правильности теории один ген —один фермент, хотя, безусловно, они и не противоречат тезису, что каждый ген контролирует образование отдельного фермента, катализирующего отдельную стадию реакции огромного метаболического ансамбля. Сам метод выделения ауксотрофов, говорил он, исключает объективность выводов, так как дает возможность обнаруживать мутанты именно такого типа, которые, судя по всему, всем хочется обнаружить. Так, если допустить, что существуют гены, контролирующие не один, а сразу очень много ферментов, то по крайней мере один из этих ферментов мог бы быть связан с незаменимой для клетки функцией. И тогда ни одно из присутствующих в полной среде относительно простых веществ не могло бы компенсировать отсутствие такой незаменимой функции. Иными словами, даже если бы допущение один ген — много ферментов было правильным, мутации в таких генах при использовании описанного метода отбора мутантов все равно бы обнаружить не удалось, так как соответствующие мутантные клетки вообще не образовывали бы колоний на агаре с полной средой. В заключение своей критики Дельбрюк предложил, чтобы поборники теории один ген — один фермент разработали такие опыты, которые бы дали возможность опровергнуть предложенную им теорию, так как если мы такими методами не располагаем, то вся масса совместимых с этим тезисом доказательств ничего не дает в его подтверждение . [c.122]

В то время как значение флуктуационного теста и метода пересева сводится сейчас лишь к тому, что в свое время с их помощью был решен очень важный вопрос, метод отпечатков остается и сейчас одним из наиболее ценных методов в исследованиях генетики бактерий. Метод отпечатков нашел широкое применение при отборе ауксотрофных мутантов, подобных тем, которые были описаны в гл. V. При использовании этого метода для выделения акусотрофов засевают ряд исходных чашек с полной средой, содержащей бульон, так что на каждой из этих чашек после инкубации вырастает несколько сот колоний прототрофных бактерий. Затем с этих исходных чашек делают отпечатки на чашки с минимальной средой. Легко обнаружить присутствие на исходной чашке с полной средой любой редкой ауксотрофной мутантной колонии эти бактерии неспо- [c.143]

Рис. 8.1. Метод перепечатывания колоний, при котором бактерии быстро переносят i с одной питательной среды на другую. На рисунке схематически изображена последовательность операций, позволяющая идентифицировать ауксотрофные мутанты, способные к росту на исходной обогащенной среде, но не образующие колоний на новой (минимальной) среде. [Stent G. S., alendar R., (1978) Mol. Geneti s,

Существенное преимущество растений по сравнению с животными, важное для генетики соматических клеток, заключается в том, что гаплоидные клетки растений можно культивировать in vitro. В процессе онтогенеза всех растений происходит смена гаплоидных и диплоидных фаз. У мхов и печеночников доминирует гаплоидная фаза. Эта фаза, называемая гаметофитом, сохраняется и у высщих растений, хотя у них она сильно редуцирована. В процессе мейоза образуются мужские и женские клетки, которые проходят несколько митотических делений. Диплоидность восстанавливается при оплодотворении. Клетки гаплоидной фазы можно поддерживать в культуре. В такой культуре клеток легко тестировать проявление рецессивных маркеров подобно тому, как это делается при работе с ауксотрофными маркерами бактерий. При использовании соответствующих селективных сред можно проводить скрининг больщих популяций клеток, подбирая условия, при которых способность к пролиферации сохраняют только нужные мутанты. [c.329]

Пенициллин убивает лишь растущие бактериальные клетки. Они влияет на синтез клеточной оболочки, и по мере роста бактериальной клетки стенка постепенно ослабевает и наконец разрывается, что приводит к гибели бактерии. Пенициллин часто используют для увеличения частоты ауксотрофных мутантов в мутагенизированной популяции клеток Е. соН. Опииште, как этого можно до-битдлях [c.30]

Между способностью осуществлять сверхсинтез веществ, связанных с функционированием универсальных метаболических систем, и таксономическим положением организма коррелятивной связи нет. В принципе любой участок метаболической системы микробной клетки, любой комплекс ферментов могут служить практическим целям [Скрябин, Головлева, 1976]. Но чтобы этого достичь, необходимо оперативное вмешательство в жизнь клетки. В результате легкого химического или ферментативного гидролиза биомассы водородных бактерий могут быть получены различные аминокислоты — лизин, триптофан, лейцин, метионин и др. Этот метод не имеет пока промышленного значения, главным образом из-за дефицита белкового Сырья. Сверхсинтетиками аминокислот, поступающих в среду. Как правило, служат ауксотрофные мутанты различных видов [c.135]

Чаргафф и его сотрудники [58] выделили ДНК из протопластов дикого штамма Е. oli и этой ДНК обрабатывали мутант, ну кдаю-щийся в лизине. Оказалось, что в результате такой обработки у бактерий, ауксотрофных по лизину, восстанавливается про-тотропный тип питания, при котором протопласт уже не нуждается в поступлении лизина извне. Эта форма бактериальной трансформации была названа ими восстановительной . [c.304]

Смотреть страницы где упоминается термин Ауксотрофные мутанты бактерий: [c.245] [c.158] [c.131] [c.131] [c.27] [c.111] [c.148] [c.150] [c.450] [c.487] [c.74] [c.121] [c.352] [c.148] [c.150] [c.286] [c.58] [c.136] [c.75] [c.235] [c.159] [c.973] [c.168] [c.159]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология