Временная экспрессия

Во многих случаях для изучения экспрессии генов млекопитающих наиболее приемлема так называемая временная экспрессия, происходящая в части клеток в течение нескольких часов после введения ДНК. Если же требуются большие количества продукта, то приходится выделять клоны, клетки которых сохраняют вектор и в ходе пролиферации. Подобное стабильное наследование вектора достигается двумя путями использованием вирусного репликона, например вируса папилломы крупного рогатого скота (ВРУ) (см. гл. 8 тома П этой серии [34]), или в результате интеграции вектора в ДНК клетки-хозяина. Известно, что любая чужеродная ДНК с низкой частотой способна встраиваться в неспецифические участки хозяйской хромосомы получившиеся клоны можно выявить, если использовать подходящий селективный маркер. В гл. 6 тома И данного издания описаны различные селектируемые векторы, а также способы их введения в культуру клеток. В этой главе мы коснемся методов, позволяющих получить высокоэффективную экспрессию интегрирующихся векторов в стабильно трансфицированных линиях клеток. [c.238]

Каждые 3—4 дня меняйте среду. Иногда через 7—8 дней на чашке появляется множество мелких колоний, возникающих в результате временной экспрессии введенного гена с /г/г. Поэтому для подсчета стабильно трансформированных колоний следует подождать 10—12 дней. [c.247]

Определенное влияние на уровень экспрессии гена могут оказывать его ориентация и положение в составе вектора. Как правило, лучшие результаты достигаются при одинаковой ориентации обоих генов вектора, когда их транскрипция происходит в одном направлении проверить влияние различной ориентации гена можно в экспериментах по временной экспрессии (см. гл. 6 книга II данной серии [34]), если, конечно, существует достаточно чувствительный способ анализа экспрессии интересующего гена. [c.261]

Последняя разработка — это использование выдержанных в растворе плазмидной ДНК вольфрамовых микрочастиц, чтобы выстрелить ДНК в большие клетки эпидермиса лука [19]. Удается получить достаточно эффективную временную экспрессию доставленных векторных последовательностей, но остается выяснить, можно ли эту технологию применить к тотипотентным клеткам культурных растений. [c.202]

Выбирают подходящую концентрацию ПЭГ для будущего анализа временной экспрессии и экспериментов по трансформации, которая бы обеспечивала хорошее поглощение вектора и адекватную выживаемость протопластов. В данном эксперименте эта концентрация составляет 20%. [c.209]

Временная экспрессия векторной ДНК в популяции обработанных протопластов. Для этого требуется измерить активность фермента, кодируемого вектором, например AT, в грубых лизатах протопластов, подвергшихся электропорации [12]. [c.215]

Оптимизация методик электропорации с помощью временной экспрессии [c.216]

Один из ПОДХОДОВ к определению оптимальных условий для электропорации протопластов состоит в анализе временной экспрессии гена в составе ДНК, которую вводят в клетки. [c.216]

Примечание соблюдайте стерильность. Работайте в ламинарном боксе, за исключением экстракции клеток для оценки временной экспрессии через 48 ч. [c.218]

Вспомогательные плазмиды, используемые для конструирования рекомбинантных вирусов, полезны сами по себе в опытах, в которых достаточно наблюдать временную экспрессию клонированных генов. [c.402]

Особое преимущество, которое дает определение нуклеотидной последовательности ДНК, состоит в возможности сравнительного анализа некодирующих областей, включая регуляторные последовательности. Это очень важно, поскольку помогает объяснить тот давно известный факт, что эволюция белков и морфологическая эволюция идут в разных группах организмов с совершенно разной скоростью. Важные фенотипические изменения могут зависеть не только от структуры белка, но и, например, от относительного содержания индивидуальных белков или от времени экспрессии гена. Сравнивая нуклеотидные последовательности регуляторных элементов или соседей по геному , можно выяснить роль регуляции работы генов в эволюции видов. Различия между последовательностями мо- [c.16]

Как мы уже отмечали, при работе с животными клетками используют два типа векторов. В некоторых случаях ОНИ аналогичны бактериальным плазмидам или фаговым векторам. После трансфекции или инфицирования эти векторы реплицируются и сохраняются в виде независимых внехромосомных геномов или упаковываются в инфекционные вирусные частицы. В других случаях векторы не способны реплицироваться и используются для введения специфических сегментов ДНК в клетки с целью изучения временной экспрессии клонированного гена или получения стабильной трансформации при встраивании вектора в геном хозяина. [c.260]

Генно-инженерные методы более перспективны для создания улучшенных сортов, так как позволяют избирательно вводить в геном растения-реципиента гены искомого признака. Операции по получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка разделены на ряд этапов 1) клонирование генов запасных белков 2) изучение механизмов тканеспецифичной и временной экспрессии белков и вьювление последовательностей [c.149]

В связи с рассматриваемой гипотезой особый интерес представляет наблюдение, сделанное недавно Ю. В. Свиткиным и В. И. Аголом (1983). Они показали, что во время трансляции РНК вируса энцефаломиокардита в определенном участке этой РНК существует трансляционный барьер, вызывающий значительную задержку во времени экспрессии последующей кодирующей последовательности. Примеча- [c.212]

Второй этап исследования — это введение ДНК в ту или иную систему транскрипции. Простейшей системой являются экстракты, приготовленные из клеток или из изолированных ядер, способные инициировать и вести транскрипцию. Однако уровень транскрипции в них невысок, и часто эффекты, выявляемые in vivo, с экстрактами наблюдать не удается. Другой подход включает инъекцию ДНК в ядра крупных клеток, например овоцитов лягушки (М. Бирнстил, Швейцария) или вьюна (М. Я. Тимофеева, Институт молекулярной биологии АН СССР). Введенная ДНК одевается белками и далее может активно транскрибироваться в овоцитах. Недостатком системы является ее гетерологичность, так как обычно работают с генами из других организмов, и ограниченность. Третья широко используемая система — это временная экспрессия при [c.69]

Трансформация протопластов ОМОТ-векторами с помощью какого-либо из методов, перечисленных в разд. 3.1.2, может быть предпринята по отношению к любому виду растений, для которого разработана система протопластов. Однако даже в этом случае, если жизнеспособные протопласты, способные к формированию клеточной стенки и делению, можно получить в достаточных количествах, у многих культурных видов такие клетки не являются тотипотентными. Таким образом, кроме работ по временной экспрессии, трансформация протопластов с помощью ВМОТ-векторов в действительности не вышла за пределы круга видов, чувствительных к агробактериям. Кроме того, существуют и значительные основания предполагать, что прохождение клеток через стадию недифференцированной культуры тканей тоже способно привести к изменениям генотипа растения. По этим двум причинам многие лаборатории в настоящее время разрабатывают методы трансформации, которые не нарушают нормальное развитие и клеточный цикл растения. [c.201]

В разд. 3.2 мы остановимся на том, как определить оптимальные условия для введения векторной ДНК в протопласты в присутствии ПЭГ, оценивая количество используемой ДНК. Поглощение ДНК контролируется с помощью гибридизации, чтобы подтвердить включение векторной ДНК в протопласты. В разд. 3.3 изложены методики электропорации протопластов и оценки эффективности процесса трансформации путем измерения временной экспрессии DMGT-вектора в клетках, полученных из обработанных протопластов. Трансформация протопластов путем микроинъекций описана в разд. 3.4. [c.203]

В данном разделе мы останавливаемся на том, как определить оптимальную концентрацию ПЭГ 6000 для эффективного поглощения плазмиды протопластами растений. Однако ту же самую схему можно использовать и для оптимизации других параметров (например, подбора ДНК-носителя, среды для поглощения, pH, времени и температуры инкубации, концентрации ДНК, условий перемешивания и предварительной обработки протопластов), которые предположительно влияют на процесс поглощения. После стимуляции эндоцитоза любая плазмида, адсорбированная на внешней стороне протопластов, удаляется с помощью ДНКазы. Затем из заданного количества протопластов выделяют суммарную ДНК и оценивают количество встроенного в нее вектора с помощью ДНК-ДНК-гибридизации, используя радиоактивно меченную ДНК вектора в качестве пробы. Кроме того, для установления целостности поглощенной векторной ДНК можно использовать блоттинг-гибридизацию по Саузерну [11]. Такие методы в сочетании с анализом временной экспрессии вектора в обработанных плазмидой клетках позволяют быстро оптимизировать процедуры трансформации с помощью ПЭГ. [c.204]

Плазмида со скринируемым маркерным геном для анализа временной экспрессии (например, p aMV AT) в дистиллированной НгО (150 мкл с концентрацией 1 мкг/мл) на льду. [c.205]

На этой стадии протопласты можно дважды отмыть MSP1 9М, определить жизнеспособность популяции, высеять клетки и культивировать как обычно (разд. 2.8). Трансформированные колонии можно отбирать, как описано в разд. 2.9, если использовались соответствующие селективные маркерные гены (например, Кт илн Hm )- В противном случае через-пару дней инкубации в культуре можно анализировать временную экспрессию ДНК, захваченной путем эндоцитоза, с помощью САТ-анализа-(разд. 6.4.2), чтобы получить доказательство эффективности поглощения ДНК в присутствии ПЭГ. Обычно мы используем для поглощения плазмиды 15%-ный ПЭГ и получаем разумную активность AT через 48% культивирования. [c.211]

Необходимо отметить, что следить за количеством и качеством доставленного внутрь клеток вектора обязательно только при разработке методики переноса гена посредством ДНК (DMGT). Наиболее важно оценить выживаемость протопластов, после трансфекции и, разумеется, наблюдать за экспрессией интернализованной ДНК. Общая стратегия заключается в определении условий, которые обеспечивают эффективное поглощение недеградированной ДНК и высокую выживаемость протопластов, а затем в анализе временной экспрессии векторной ДНК в популяции протопластов через несколько дней после обработки ПЭГ. Как только экспрессия маркерных генов будет оптимизирована, появится потенциальная возможность селекции отдельных трансформированных колоний. [c.212]

С помощью электропорации были получены стабильно трансформированные растения или клеточные линии некоторых видов растений. К йх числу относятся табак [38], морковь [22] и кукуруза [13]. Шиллито с соавторами [38] использовал вектор, содержащий доминантный селективный маркерный ген (npt-ll), который ранее успешно применяли в экспериментах по пере носу генов с помощью ПЭГ [31]. Эту плазмиду вводили с помощью электропорации в протопласты табака и отбирали трансформанты на основе резистентности к канамицину. Дан<-ные исследования, очевидно, отнимают больше времени, чем эксперименты по временной экспрессии, но в конечном итоге позволяют разработать методику стабильной трансформации. В настоящее время при использовании методов электропорации частота трансформированных колоний может достигать 2%. что более эффективно, чем трансфекция ДНК с помощью ПЭГ. Пути интеграции перенесенной ДНК такие же, как и при иС пользовании ПЭГ, и в обоих случаях перенесенные гены наследуются в соответствии с нормальными менделевскими соотношениями. [c.216]

L Определяют активность AT, как указано в разд. 6.4.2. На рис. 3.6 показаны результаты эксперимента, в котором в протопласты Р. hybrida вводили p aMV AT путем электропорации с помощью прибора Kruss и описываемой методики. Очевидно, что напряженность 2000 В/см и длительность импульса 10 мкс обеспечивают оптимальный уровень временной экспрессии AT при ограниченных потерях выживаемости протопластов. [c.219]

Получение временной экспрессии генов в клетках OS часто используется для быстрой наработки рекомбинантных белков и ДНК. При конструировании клеток OS клетки зеленой мартышки V-1 были трансформированы вирусом SV40 с дефектной областью начала репликации. В результате были получены три линии клеток ( 0S-1, 2 и 7), конститутивно экспрессирующих большой Т-антиген вируса. После проведения трансфекции клеток экспрессирующими плазмидами, содержащими область начала репликации вируса SV40, последняя эффективно взаимодействует с эн- [c.180]

Плазмиды без эукариотического репликатора. Замена в плазмидах типа pSV промотора SV40 на промотор вируса саркомы Рауса, расположенного в его LTR-повторе, дела экспрессию селектируемых генов в образовавшихся векторах pRS V-gp/n pRSV-пео еше более эффективной. Конечно, эти векторы тспользуют для наблюдения временной экспрессии. Этой же цели служат и аналогичные векторы серии pFV, предназначенные для экспрессии чужеродных генов в клетках рыб (Liu et al, 1990). Их экспрессионная кассета состоит из промотора, энхансера и интрона гена (3-актина карпа и сайта полиаденилирования гена гормона роста лосося (рис. 13.6,в). Примечательно, что эта кассета работает и в клетках животных. [c.408]

Аденовирусные векторы первого поколения (с делецией локуса El, см. с. 404) сохранили поздние гены, кодирующие структурные белки. Это является еще одной причиной их нестабильности. Введенные в организм клетки с вирусными белками воспринимаются как чужеродные и постепенно элиминируются иммунной системой. Эти факты говорят о том, что аденовирусные векгоры больше подходят для терапии рака, где достаточно временной экспрессии терапевтических генов, чем для исправления наследственных дефектов. [c.424]

Недостатком рецептор-опосредованного гереноса генов (как и всех методов трансформации) является временность экспрессии перенесенных генов, что заставляет прибегать к повторны процедурам генной терапии. [c.430]

Обработка клеток ДНК в присутствии ДЭАЭ-декстрана столь же, а иногда и более эффективна, как и обработка кальцийфосфатным преципитатом ДНК в случае временной экспрессии чужеродных генов, но по неизвестным причинам выход генетически трансформированных клеток существенно ниже в первом случае [Г1, 13]. Показано, что ДЭАЭ-декстран связывается с ДНК,нейтрализуя ее заряд и изменяя конформацию молекулы ДНК, что делает последнюю устойчивой к ДНКазам и нагреванию, и, кроме того, взаимодействует с мембраной клеток, стимулируя эндоцитоз, причем сам ДЭАЭ-декстран не проникает в клетки [23, 24]. Оптимальные концентрации векторной ДНК и ДЭАЭ-декстрана различаются для клеток разных линий. Как и при введении ДНК в комплексе с фосфатом кальция, обработка клеток мембранотропными агентами (ДМСО, глицерином или ПЭГ [25]) или изменение иных условий (например, обработка клеток в суспензии, а не в монослое [13, 26] или культивирование их в атмосфере с 2 %, а не с 5—10 % СОг [27]) может повысить эффективность введения чужеродных генов в соматические клетки. [c.207]

Геном поксвирусов представлен линейной двухцепочечной ДНК с ковалентно замкнутыми концами. Размер ДНК ортопоксвирусов варьирует от 175 до 230 тпн в зависимости от вида и штамма вируса, а их геном кодирует около 200 полипептидов. Гены по времени экспрессии делят на ранние (Е), промежуточные (I), поздние (L), а также экспрессируемые в течение всего цикла развития вируса — ранне-поздние (E-L). Ранняя транскрипция происходит сразу после вхождения вириона в клетку и осуществляется вирион-ассоциированной РНК-полиме-разой, С промежуточных промоторов транскрипция инициируется только после репликации вирусной ДНК, но в составе гибридных плазмид 1-гены могут транскрибироваться без предшествующей репликации ДНК. Для транскрипции поздних генов необходима не только предшествующая репликация вирусной ДНК, но и экспрессия ранних и промежуточных генов. Кодирующие последовательности генов данных цитоплазматических вирусов непрерывны, и сплайсинг отсутствует. [c.392]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология