Лактатдегидрогеназа, аффинная

Присутствие пирувата увеличивает стабильность комплекса фермента с иммобилизованным коферментом, повышая сродство лактатдегидрогеназы к этому сорбенту по сравнению с другими NAD-зависимыми ферментами. Подобный метод называют аффинной элюцией. [c.247]

Рис. 5.2. Аффинная гель-фильтрация синтетических смесей (объем образца 50 мкл) бычьего сывороточного альбумина (0,8 мг) с лактатдегидрогеназой (1,85 Е) (о) и малатдегидрогеназой (0,335 Е) (б) [18].

Рис. 5.7. Влияние распределения аффинного лиганда на емкость 1 -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозы по лактатдегидрогеназе [6].

Для полимеров с различной концентрацией иммобилизованного лиганда, однородно распределенного по гелю, связывание фермента, например лактатдегидрогеназы, зависит от концентрации лиганда таким же образом, как и при непосредственном разбавлении аффинного геля незамещенной сефарозой. Более сильное связывание, наблюдаемое с гетерогенными полимерами, отражает, возможно, способ разбавления, так как в этих условиях могут сохраняться участки на колонке, в которых концентрация лиганда все еще остается равной концентрации первоначального неразбавленного геля. [c.104]

Кроме того, при связывании с лигандом могут происходить конформационные перестройки белка. Известно, что конформа-дионные изменения действительно имеют место [59, 60], и они Могут значительно изменить взаимодействие белка с адсорбентом в любом направлении. Убедительных доказательств кон-формационных изменений, приводящих к более прочной сорбции, не было получено, хотя для некоторых ферментов, особен- Яо для енолазы из дрожжей, эффекты, связанные с аффинной элюцией, столь слабы (значительно слабее ожидаемых эффектов при изменении заряда), что такие усиливающие сорбцию конформационные изменения вполне могут существовать. Конформационные изменения, вызывающие ослабление адсорбции, по-видимому, действительно имеют место, особенно в случае фосфоглицераткиназы, аденилаткиназы и лактатдегидрогеназы 38, 48]. [c.138]

Прп.менение линейного градиента температуры для разделения смеси дрожжевой алгокольдегидрогеназы, глицерокиназы, гексоки-назы и лактатдегидрогеназы аффинной хроматографией на №-(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозе [15] показано на рис. 10.7. Интересно, что глицерокипаза и дрожжевая алкогольдегидрогеназа элюируются в порядке, предсказываемом на основе их наблюдаемых энергий адсорбции с высоким выходом (70—90%), в то время как лактатдегидрогеназа требует ударного элюирования 5 мМ [c.268]

Хроматография на КМ-целлюлозе. Аффинная элюция. Измеряют pH раствора и доводят его соляной кислотой до 7,2. Раствор белка наносят на колонку с КМ-целлюлозой (13X5,5 см), уравновешенную буфером А, pH 7,2. После того как белок адсорбировался на колонке, ее промывают 75—100 мл буфера А (скорость тока 200 мл/ч). На этой стадии может потребоваться использование перистальтического насоса. Затем колонку промывают буфером Б, pH 8,0. При этом элюируются различные примесные белки, а лактатдегидрогеназа остается связанной с носителем. После того как через колонку пройдет 5—6 объемов буфера Б, оптическая плотность элюата при 280 нм начинает уменьшаться. Необходимо продолжать промывание буфером Б до тех пор, пока снижение Л280 не прекратится ( 280 может достигнуть значения 0,1—0,2 или меньше). Затем на колонку подают буфер В. После прохождения через колонку 1—2 объемов этого буфера определяют активность лактатдегидрогеназы в собираемых фракциях. В случае ее отсутствия на колонку подают буфер Г. Определяют активность лактатдегидрогеназы во фракциях элюата. Если ее нет либо она незначительна, на колонку подают буфер Д. Собирают фракции, определяют в них активность фермента и содержание белка (по поглощению при 280 нм за вычетом фона, который дает НАДН). Фракции, содержащие наибольшую активность, объединяют и добавляют к ним ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ и мелкоизмельченный сульфат аммония для кристаллизации. [c.276]

Образец (100 мкл) фермента (5 Е) и бычьего сывороточного альбумина (1,5 мг) наносили на колонку (50x5 мм), содержащую 1.0 г аффинного сорбента, разбавленного до необходимой концентрации лиганда сефарозой 4В. / — лактатдегидрогеназа из скелетных мышц кролика 2 — лактатдегидрогеназа из мышц сердца свиньи 3 — глицерокииаза. [c.25]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

Рис. 5.8. Связываемость малатдегидрогеназы (1), лактатдегидрогеназы из мышцы сердца свиньи (2) и глицерокиназы (3) на N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе в зависимости от концентрации аффинного лиганда [8].

В колоночной аффинной хроматографии достаточно сильное взаимодействие выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом приводит к концентрированию вещества и его медленной миграции вниз по колонке. Этот процесс зависит от концентрации лиганда и почти не зависит от начальной концентрации свободных макромолекул. Например, в аффинной хроматографии глицерокиназы или лактатдегидрогеназы на К -(6-аминогексил)-5 -АМР— сефарозе не наблюдалось влияния концентрации фермента на емкость, если концентрации ферментов прямо пропорциональны концентрациям нуклеотида или зависимость между ними близка к таковой [21]. Необходимые при этом требования заключаются в том, что комплементарные макромолекулы следует наносить на колонку в ненасыщающих количествах, а также подбирать скорость потока раствора [19]. [c.82]

Из сопоставления ВЭТТ можно сделать важные практические выводы, а именно найти аффинный сорбент, характеризующийся не только хорошей связываемостью, но и лучшей избирательностью. Очевидно, таким образом Олсон и др. [28] обнаружили, что необходимо прекратить поток раствора в колонке за несколько часов перед специфическим элюированием. Время уравновешивания не влияет на связываемость лактатдегидрогеназы на иммобилизованном NAD+ или на связываемость глицерокиназы на иммобилизованном АТР, если перед элюированием ферменты в течение 1,5 и 20 ч соответственно оставлять в контакте с иммобилизованными нуклеотидами [19]. Этот факт можно использовать для хранения ферментов, устойчивость которых зависит от присутствия субстратов или кофакторов. [c.83]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

В работе Олсона и др. [1] при разделении ферментов и антигенов аффинной хроматографией. применялись методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую отличают использование небольших колонок, высоких скоростей разделения, связанных с этим высоких давлений в системе и, что наиболее существенно, относительно небольших количеств анализируемых веществ. Носителем для иммобилизации аффинных лигандов служил силикагель, поскольку получаемые аффинные сорбенты на этом носителе могут работать в условиях высокого давления. Наиболее ярким примером эффективности такого метода служит разделение в течение 5 мин Н4 и М4 изозимов лактатдегидрогеназы на колонке с №-(6-аминогексил)-АМР—силикагелем в градиенте NADH. [c.452]

С использованием одного и того же аффинного адсорбента АМР-агарозы в работе [6] изучено также влияние скорости потока и времени инкубации на связывание лактатдегидрогеназы при низкой концентрации фермента (0,6 Е/мл). На рис. 3 показано, что в условиях бетч-процесса имеет место быстрое уве- [c.105]

Изучение влияния pH и температуры проведено на адсорбентах, специфичных к группе ферментов 10, 11]. Влияние pH на связывание лактатдегидрогеназы из сердечной мышцы с двумя аффинными адсорбентами представлено на рис. 6. Взаимодействие фермента с обоими адсорбентами явно не зависит от концентрации ионов водорода в растворе вплоть до pH 8, но в более щелочной области наблюдалась зависимость от природы адсорбента. В случае б-аминогексаноил-ЫАО+-сефа-розы поведение фермента характеризовалось кажущейся константой рК 8,5, в то время как для Ы -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозы р/С 9,7. Различия между значениями кажущихся констант рК, определенных для двух иммобилизованных [c.109]

В работе [11] показано, что изменение температуры можно использовать с целью элюирования ферментов с аффинных адсорбентов. На рис. 9 приведены результаты разделения дрожжевой алкогольдегидрогеназы, глицерокиназы, гексокиназы и лактатдегидрогеназы на иммобилизованном 5 -АМР с использованием линейного градиента температуры. Уместно заметить, что глицерокиназа и дрожжевая алкогольдегидрогеназа элюируются в порядке, соответствующем их кажущимся энергиям адсорбции с почти количественным выходом (70—90%), в то время как для элюирования лактатдегидрогеназы даже при [c.117]

Зональный метод количественной аффинной хроматографии [1, 2, 5] в настоящее время пользуется большей популярностью, чем фронтальный, главным образом из-за применения в последнем методе слишком большого количества растворенного вещества. Однако различия в требуемом количестве растворенного вещества не так велики, как может показаться на первый взгляд. Хотя в случае фронтального эксперимента объем вводимого раствора гораздо больше, концентрация может быть значительно ниже ввиду отсутствия далее в работе какого бы то ни было разбавления. Это положение становится совершенно очевидным из рис. 1, на котором представлены восходящие профили элюирования при различных концентрациях NADH при фронтальной аффинной хроматографии лактатдегидрогеназы печени крысы на колонке объемом 0,1 мл (0,08x5,0 см) с 10-карбокси-дециламино-сефарозой в сравнении с соответствующими профилями, полученными при зональной хроматографии на колонке с тем же аффинным адсорбентом, объем которой в 10 раз больше (0,50X1,28 см) [20]. [c.199]

На протяжении последнего десятилетия мы стали свидетелями появления количественной аффинной хроматографии как метода изучения взаимодействий между различными реагирующими веществами. Этот еще относительно молодой метод вызывает несомненный интерес, поскольку в некоторых случаях дает возможность на основе специфического взаимодействия с иммобилизованным реагентом количественно оценивать обратимую реакцию, протекающую в биологических условиях, что продемонстрировано на примере использования оксамат-сефарозы для изучения взаимодействия NADH с различными изоферментными формами лактатдегидрогеназы в неочищенном тканевом экстракте [6]. Другим преимуществом аффинной хроматографии, вероятно, является отсутствие каких-либо ограничений для значений констант равновесия, которые могут быть измерены этим методом. Из двух рассмотренных здесь подробно примеров очевидно, что количественная аффинная хроматография весьма удобна для характеристики относительно слабых взаимодействий ( As<1000 М ), оценка которых вызывает затруднения при использовании других методов, таких, как равновесный диализ , из-за сложности измерения различий между полной и свободной [c.214]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология