Электрофорез вертикальные системы

Максимальное разделение достигается при использовании диск-электрофореза в ПААГ. (Название диск — от дискретного напряжения электрического поля, что обеспечивается прерывистым градиентом pH в системе.) Суть метода заключается в следующем. В стеклянной вертикальной трубке полимеризуют гель неодинаковой концентрации. Верхняя часть (область образца до 100 мкм толщиной) и средняя (прокладка) имеют меньшую концентрацию, чем нижняя часть — разделяющий гель. Образец наносят на верхнюю часть геля. (Иногда верхний гель [c.113]

Для успешного электрофореза необходим канал , в котором происходит разделение. Он может представлять собой колонку (вертикальную), плоскую ванну или прямоугольный блок (горизонтальный), в которых движутся белки. Связь обоих концов этого канала с электродами осуществляется через большие резервуары с буфером. Необходима также система охлаждения, чтобы поддерживать постоянной температуру канала . Из-за того что в свободном растворе трудно поддерживать устойчивую границу, буфер в этом канале может быть смешан с инертным порошком или материалом в виде гранул, что позволяет снизить до минимума как гравитационную, так и диффузионную нестабильность. Простейшая система представляет собой горизонтальный блок. Сухой порошок крахмала, сефадекс 0-25 (не удерживающий белок) или порошок любого другого полимерного материала смешивают с буфером так, чтобы образовалась густая суспензия, которую вносят в прибор. Избыток буфера удаляют. Вместо суспензии можно использовать очень крупнопористый гель, например 2%-ный агар или агарозу. Концы геля соединяют с увлажняемой тканью или другим материалом, образующим контакт с наполненными буфером резервуарами, в которые помещены электроды (рис. 5.14). [c.217]

Системы вертикального гель-электрофореза [c.220]

Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор электродного буфера, находящегося в контакте с белковым препаратом и формирующим гелем ( верхнего буфера в случае использования системы с вертикальным расположением геля). [c.66]

Аппараты для высоковольтного электрофореза, относящиеся к другой группе, устроены таким образом, что фильтровальная бумага погружена в охлаждающую жидкость, не смешивающуюся с водой тепло, воспринятое этой жидкостью, поглощается затем в системе водяным охлаждением. В таких аппаратах бумага помещается вертикально между двумя ваннами, содержащими буферный раствор. В связи с вертикальной укладкой бумаги важно правильно выбрать полярность электродов. Из-за электроэндоосмоса происходит перемещение буферного раствора от анода к катоду. Если, например, отрицательный полюс источника тока соединить с верхней ванной, то специфическое образование хвостов при электрофорезе, вызванное электроэндоосмотическим потоком снизу вверх,, будет полностью компенсировано неспецифическим образованием хвостов , обусловленным движением буферного раствора сверху вниз под влиянием силы тяжести. [c.114]

В методе иммунодиффузии наблюдается полоса преципитадии при диффузии препарата в гель, содержащий антитела. Каждая система антиген—антитело образует свою полосу. Диффузия может быть проведена в тонкой пленке геля или в вертикальных трубках. При помощи иммунофореза можно разделить очень сложную смесь близких по физико-химическим свойствам гликопротеинов. Первоначально проводится электрофорез в агар-агаровом геле, а затем иммунодиффузия ( перпендикулярном направлении). [c.75]

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами ЮОХЮО мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных ( прерывистых ) буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках. [c.265]

И др.) мигрируют в этой системе вместе с НЬА. Леман и Хунц-ман [753] обращают внимание исследователей на большие различия между разными марками агара. Шнейдер и др. [1143] предложили модификацию электрофореза в цитрат-агаровой системе. Они применяют пластинки из ацетата целлюлозы на миларовой подложке, пропитанные забуференным агаром. Пластинки ацетата целлюлозы вымачивают 1 ч в воде, дают воде стечь и слегка их подсушивают фильтровальной бумагой. Затем пластинки помещают в штатив в вертикальном положении, погружают в 1%-ный раствор агара в 0,05 М цитратном буфере (pH 6,0) и выдерживают 30 мин при 60 °С. После этого дают стечь избытку агара и переносят каждую пластинку в отдельный герметично закрывающийся пластмассовый пакет, содержащий небольшое количество буфера. В такой упаковке пластинки можно хранить в холодильнике длительное время. Очень важно быстро наносить образцы на пластинки, чтобы избежать опасности нх высыхания во время всех этих манипуляций. Поскольку пластинки покрыты очень тонким слоем агара, при электрофорезе можно применять высокое напряжение, что позволяет уменьшить время разделения. [c.323]

Пастевка и др. [974] определяли подвижность компонентов трех основных типов гаптоглобина с помощью дпск-электрофо-реза в полиакриламидном геле, используя в качестве стандарта трансферрин С. Эти авторы пытались идентифицировать фенотип Нр в анализируемых сыворотках по характеру расположения белковых зон на электрофореграмме после их окрашивания амидовым черным. Феррис и др, [378] анализировали комплексы гаптоглобин — гемоглобин методом вертикального электрофореза в пластине 7%-ного полиакриламидного геля с буферной системой трис-борат-ЭДТА (pH 8,3—8,4). Шеридан и др. [1178] для разделения комплексов гемоглобин — гаптоглобин применяли электрофорез в непрерывном вогнутом градиенте концентрации геля. Такая методика лучше, чем другие, обеспечивает разделение полимерных форм, особенно в зоне высокополимерных комплексов. [c.342]

Концентрацию буфера выбирают, исходя из допустимой мощности тепловыделения, и вместе с тем так, чтобы напряженность электрического поля в геле не превышала 15 В/см. При более высоких значениях напряженности возможны искажения формы белковых полос. Для 0,1 М Трис-глицинового буфера, например, такой напряженности отвечает плотность тока 20 мА/см. Это означает, что через трубку диаметром 6 мм и длиной 8 см в этом случае можно пропускать ток до 5,5 мА при напряжении 120 В. Поскольку трубки довольно трудно охлаждать, обычно используют меньшие величины тока — около 3 мА на трубку. Для вертикальной пластины размером 10X14 см и толщиной 1,5 мм в этих же условиях сила тока составит около 30 мА при напряжении около 210 В. Разумеется, эти цифры приведены лишь для ориентировки, и для других условий электрофореза они окажутся иными. Впрочем, вариации для хорошо выбранных систем оказываются не очень значительными, так как для любой буферной системы сохраняется одна и та же тенденция — использовать максимально возможную напряженность поля при максимально допустимой с точки зрения теплоотвода мощности тока. [c.49]

Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор электродного буфера, находящегося в контакте с белковым препаратом и формирующим гелем ( верхнего буфера в случае использования системы с вертикальным расположением геля). В этом буфере пддвижность иона, мигрирующего в том же на- [c.66]

Горизонтальный блочный электрофорез не нашел широкого применения, несмотря на то что он не нуждается в сложной аппаратуре. Вертикальный колоночный электрофорез, особенно-в геле, используется значительно чаще. В отсутствие геля есть два способа стабилизировать жидкость в колонке они используются также при изоэлектрическом фокусировании и изотахо-форезе (см. разд. 5.3). Один из них основан на том же принципе, который используется в горизонтальных системах, — это заполнение большей части объема колонки инертным порошком,, так что миграция белка происходит в эффективном объеме между частицами. Второй способ заключается в гравитационной стабилизации жидкости с помощью градиента плотности сахарозы. Плотный раствор сахарозы помещают на дно колонки, а поверх него наслаивают раствор с равномерно убывающей плотностью, так что в верхней части колонки, куда вводят образец, концентрация сахарозы равна или почти равна нулю. Следует отметить, что сахароза в колонке лишь стабилизирует жидкость, сводя к минимуму конвекционные токи. Она лишь немного влияет на миграцию белка вследствие увеличения вязкости по мере перемещения белка вниз по колонке. Это замедляет движение белка, но вместе с тем снижает его диффузию. Обычный способ удалить белок из колонки после электрофореза — это просто дать жидкости стечь и собрать ее в виде фракций с помощью коллектора. Эту операцию нужно делать медленно, чтобы не перемешать отдельные зоны белка, движущиеся вниз по колонке. [c.220]

Для достижения максимального разделения используют диск-электрофорез— важное усовершенствование зонального электрофореза. (Как будет видно, термин диск относится не к форме полос, получаемых в этом методе, а к тому, что в системе используются неоднородные значения pH, что приводит к прерывистому напряжению.) Метод состоит в том, что первоначальный тонкий слой образца (1—2 мм) концентрируется в сверхтонкую стартовую зону толщиной от 1 до 100 мкм, как показано на рис. 9-12. Заметим, что гель находится в вертикальной колонке и представляет собой три отдельные области верхнюю, или область образца, среднюю, называемую прокладкой, и нижнюю, состоящую из собственно разделяющего геля. Область образца и гель-прокладка имеют меньшую концентрацию (больший размер пор), чем разделяющий гель, и готовятся в бустере с низкой ионной силой и различными значениями pH. Больший размер пор верхних слоев геля означает, что молекулы в них задерживаются меньше, двигаясь при этом быстрее, чем в нижнем геле. Кроме того, меньшая ионная сила обусловливает большее электрическое сопротивление, поэтому электрическое поле (Б/см) в верхнем геле больше, что также приводит к большей скорости движения молекул в верхнем геле по сравнению с нижним гелем. Соотношение значений pH по слоям приводит к такому же влиянию на подвижность. Быстрое движение через верхние слои геля приводит к накопле [c.235]

Для вертикальной пластины размером 10 Я4 см и толщиной 1,5 мм в этих же условиях сила тока составит около 30 мА при напряжении около 210 В. Разумеется, эти цифры приведены лишь для ориентировки, и для других условий электрофореза они окажутся иными. Впрочем, вариации для хорошо выбранных систем оказьюаются не очень значительными, так как для любой буферной системы сохраняется одна и та же тенденция — использовать максимально возможную напряженность поля при максимально допустимой с точки зрения теплоотвода мощности тока. [c.49]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология