Ферментные метки

Наибольшее распространение получили методы введения ферментной метки, основанные на образовании ковалентной связи между молекулами антитела и фермента. Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов окислением углеводного компонента фермента перйодатом натрия. В случае использования щелочной фосфатазы в качестве фермента-маркера применяют глутаровый альдегид, взаимодействующий с е-аминогруп-пами белковых молекул. [c.317]

Интересным развитием идеи использовать ферментные метки является контроль соотношения связанный свободный> путем изменения активности фермента в результате связывания в конъюгат с антителом или дополнительного связывания антиферментных антител. Такие способы анализа не нуждаются в этапе разделения, а значит, можно упростить проведение определения. Разработано несколько способов гомогенного ферментативного иммунного анализа (ФИА). [c.595]

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ С ФЕРМЕНТНОЙ МЕТКОЙ [c.318]

Конъюгаты антител с ферментной меткой. [c.318]

Ферментные метки Общий принцип [c.594]

АТ — иммобилизованные антитела АГ — определяемый антиген АТ—Е — конъюгат антител с ферментной меткой [c.319]

Присоединение ферментной метки не должно блокировать место распознавания [c.595]

Для определения специфичности гибридом используют, как правило, непрямой метод ИФА с использованием антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой. В нашем случае используются [c.320]

АГ — иммобилизованный антиген АТ — определяемые антитела АЛТ—Е — конъюгат антивидовых антител с ферментной меткой [c.320]

АГ — иммобилизованный антиген АТ—Е — конъюгат антител с ферментной меткой [c.322]

О Для проведения колориметрического иммунного анализа с ферментной меткой ферментативная реакция должна приводить к образованию окрашенного продукта. [c.597]

Р Биолюминесценция предлагает очень чувствительный способ определения ферментной метки. [c.598]

Рабочие титры антител определяют в реакции ИФА методом шахматного титрования с использованием сэндвич -метода ИФА. Суть метода заключается в использовании подложки , т. е. слоя неспецифически сорбированных иммуноглобулинов, с которыми затем взаимодействует специфический антиген. Этот антиген в дальнейшем выявляется с помощью конъюгатов антител с ферментной меткой. Схема сэндвич -метода представлена на рис. 38. 96-луночный микропланшет заполняют раствором антител в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл в лунку и оставляют на ночь при 4 С. На следующий день после 3-кратного отмывания фосфатным буфером с твином-20 (с. 321) титруют положительный антиген по короткому ряду микропланшета, так же титруют отрицательный антиген . После инкубации в течение 1 ч при 37° С и последующего 3-кратного отмывания в таких же условиях титруют конъюгат антител в буфере по длинному ряду микропланшета. [c.319]

Метод гомогенного ИФА без использования твердой фазы основан на различии каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунном комплексе. В настоящее время тер >ган гомогенный иммуноанализ применяют к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и регистрация глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе. [c.115]

Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма широкое распространение, однако в некоторых случаях действие сшивающего реагента отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес представляют иммунологические методы введения ферментной метки. [c.112]

Во всех методах ИФА может измеряться ферментативная активность меченого соединения, находящегося в специфическом иммунном комплексе или же в комплексе со свободными, не вступившими в реакцию центрами связывания. Именно этот принцип может быть положен в основу классификации всех методов ИФА. В первой группе методов ИФА тип I, схема 4.1) ферментная метка находится в образовавшемся специфическом комплексе анализируемого антигена и антитела, поэтому очевидно, что возрастание концентрации определяемого соединения будет сопровождаться увеличением концентрации образующегося специфического иммунохимического комплекса, а следовательно, более высоким регистрируемым сигналом. Очевидно, что в этом случае калибровочный график, представляющий собой зависимость регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого соединения, должен описываться возрастающей функцией. [c.79]

Во второй группе методов тип II, схема 4.1) с помощью ферментной метки выявляются-оставшиеся свободными центры связывания. Следовательно, калибровочная кривая описывает уменьшение регистрируемого сигнала от максимального значения, соответствующего нулевой концентрации антигена до определенного уровня, характеризующего концентрацию исследуемого антигена. [c.79]

Основной проблемой, стоящей особенно остро при введении ферментной метки в низкомолекулярные соединения, является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченых гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок — гаптен для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен — фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченых гаптенов является доступность очищенного антигена в значи-гельном количестве, что осуществимо далеко не всегда. [c.100]

Иммуноферментвый анализ (ИФА) является в настоящее время одним из наиболее активно развивающихся направлений аналитической биохимии. В этом методе высокая чувствительность определения ферментной метки (менее 10 М) сочетается с уникальной специфичностью иммунохимического анализа. Достижению высокой чувствительности ИФА способствует использование различных инструментальных методов для регистрации активности ферментов — спектрофотометрических, флуориметрических, хеми- и биолюминесцентных, электрохимических. [c.115]

Вторым обш,им недостатком конкурентных методов ИФА является возможность влияния различных эффекторов, содержаш,ихся в анализируемых биологических жидкостях (сыворотка крови, сок растения, экстракты тканей и т. д.), на каталитические свойства ферментной метки. Во многих случаях подобный эффект может быть устранен путем многократного разведения исходного образца. Однако возможность его разведения зависит от содержания исследуемого соединения, что должно быть учтено при выборе схемы ИФА. [c.102]

Методы гетерогенного ИФА, основанные на нековалентном способе введения ферментной метки [c.102]

При добавлении фермента образуется комплекс (Fab ) 2-фермент, который может применяться для определения антигена в рассмотренных выше методах ИФА с использованием меченых специфических антител (например, в сэндвич -методе). При необходимости ферментная метка может вводиться после взаимодействия гибридного антитела с определяемым антигеном. Хотя этот подход был предложен около 20 лет назад и привлекает своей элегантностью , он не нашел практического применения из-за трудоемкости получения реагентов. [c.105]

Определение константы связывания. Используют метод радиоиммунного анализа (РИА). Постановка метода сходна с постановкой ИФА (с. 320), с тем исключением, что вместо конъюгатов антител с ферментной меткой для выявления связывания антител с антигеном используют антимышиные антитела с радиоактивной меткой. В каждую лунку вносят по 50—100 мкл антимышиных антител (10—30 нг около 20 000 срт). Инкубируют при комнатной температуре около 2 ч. Затем микропланшеты тщательно отмывают (с. 321), разрезают и индивидуальные лунки просчитывают в Y-счетчике. [c.324]

Готовят растворы двух препаратов инсулина в концентрации 100 мкг/мл и раститровывают в микропланшете для ИФА в концентрациях от 10 мкг до 5-10-5 мкг в лунку. Инкубируют в течение ночи при 4°С, тщательно отмывают. В лунки вносят раствор антител к свиному инсулину в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл. Инкубируют в течение часа при 37 °С, тщательно отмывают. Вносят конъюгат антимышиных антител с ферментной меткой и инкубируют в течение часа при 37 °С. Тщательно отмывают и вносят соответствующий субстрат (с. 319). Через 30 мин определяют величину оптической плотности при соответствующей длине волны (с. 320). Строят графики зависимости величины оптической плотности от разведения антигена. Полученные графики должны свидетельствовать о том, что специфичность связывания антител к свиному инсулину значительно выше по сравнению со связыванием бычьего инсулина, хотя в последнем случае и наблюдается специфическое связывание. Такой результат свидетельствует [c.327]

К флуоресцентным измерениям имеет очевидное преих щесгво более сильного сигнала в сравнении с обычной флуорофорной меткой, поскольку каждая ферментная метка создает много флуоресцирующих молекул. [c.598]

Основным источником ошибок при образовании сигнала является какое-либо ингибирование метки. Например, флуорофор может тушиться эндогенными частицами пробы или на ферментную метку может влиять присутствие ингибиторов либо усилителей. Как было показано ранее прн обсуждении, эти [c.603]

Ферментные метки. Каким образом ферменты могут выступать в качестве маркеров иммунохимических реакций, т. е. каким образом можно детектировать ферменты и в каких минимальных количествах Попадая в раствор, молекула фермента за одну секунду может превратить определенное количество субстрата в продукт. Допустим, что фермент за секунду может образовать тысячу молекул продукта, тогда за 17 мин это количество составит миллион. Если минимальное количество продукта, которое можно обнаружить фотометрическим методом, составляет 10 молекул/мл, то это означает, что для получения такого количества продукта необходимо 10 молекул/мл фермента, т. е. 10 моль/л. Чем выше чувствительность метода, тем меньшее количество фермента может быть обнаружено. Так, например, используя хемилюминесцентный или флуоресцентный метод детекции продукта, можно определять до 10 молекул фермента в 1 мл. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях например, если измерение проводят в очень мутной среде, применяются другие методы определения ферментативной активности электрохимические, микрокалориметрические и т. д. [c.108]

В 1972 г. Рубенштейн с сотр. (К. Е. Rubenstein et al., 1972) разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в имму-нохимическом комплексе. В дальнейшем термин гомогенный иммуноанализ стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе. [c.7]

В иммуноферментном анализе введение ферментной метки осуществляют путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена или антитела, При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации. В водном растворе молекулы белков обладают структурой, при которой в поверхностном слое располагаются преимущественно гидрофильные боковые цепи отдельных аминокислотных остатков, часть из которых находится в ионизированном состоянии. Среди этих функциональных групп наиболее удобными для связывания являются е-аминогруппы лизина, карбоксильные группы аспарагинового или глутаминового остатков, 8Н-группа цистеинового остатка. Очевидно, что такая модифика ция ие должна затрагивать функдиональных групп активного [c.57]

Возможность применения ферментов в качестве метки в иммуно анализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитическо активностью, позволяющей с применением соответствующих суб стратных систем регистрировать ферменты в растворе на уррвн( 10-15 д ниже. Благодаря широкому развитию методов энзимоло ГИИ принципиально решена проблема введения ферментной метки I молекулы антигенов и антител, что позволяет в настоящий момент легко осуществить связывание молекул ферментов с другими соеди нениями с целью получения соответствующих конъюгатов. [c.78]

Многообразие методов гетерогенного анализа, относящихся к типам I и II, обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и в молекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является, какой из реагентов—антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде для разделения иммунохимических комплексов от несвязавщихся компонентов. Поэтому принцип разделения гетерогенных методов может быть представлен схемой 4.3. [c.83]

Следует отметить, что с иммобилизованным антигеном могут связываться не только свободные меченые антитела, но и антитела, провзаимодействовавшие с определенным антигеном только одним активным центром. Вероятность такого взаимодействия возрастает с уменьшением размеров антигена, что следует учитывать при определении конкретных соединений. Разделение компонентов на иммуносорбенте целесообразно проводить в кинетическом режиме, поэтому эта стадия не лимитирует время анализа в целом. Недостаткам метода является контакт ферментной метки с анализируемым образцом, что может вызвать изменение ферментативной активности. [c.93]

Метод более длителен в проведении по сравнению с предыдущим, однако в нем исключается контакт исследуемой жидкости с ферментной меткой и можно иСпользовать, одий и тот же антивидо-вой конъюгат для анализа различных антигенов. , [c.94]

Введение ферментной метки через комплекс со специфическими антителами против фермента наиболее часто применяется при использовании в качестве метки пероксидазы хрена. Этот анализ встречается в литературе под названием ПАП-метода (ПАП—пероксидаза—антипероксидаза). [c.103]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология