Панкреатический дисульфидные связи

Рибонуклеаза. — Одна из рибонуклеаз была выделена в кристаллическом виде из бычьей поджелудочной железы Купит-цем (1940). Панкреатическая рибонуклеаза гидролизует рибонуклео-тидные связи, в которых пиримидиновый нуклеозид этерифицирован по З -положению сахара. Этот фермент содержит 124 остатка аминокислот и четыре дисульфидные связи. Установление первичной структуры этого фермента Муром и Штейном (1960) явилось важной вехой в химии белка. Последовательность частично была определена на окисленной рибонуклеазе, которая при энзиматическом расщеплении дает 24 пептида. Их размеры позволяют непосредственно определить последовательность химическими и ферментативными методами. Наконец, ферментативный гидролиз нативного белка, разделение содержащих цистин пептидов, окисление их до цистеиновых пептидов и аминокислотный анализ последних позволили выяснить, каким образом восемь по-луци1стинооых о статков связаны друг с другом (рис. 27, стр. 740). [c.739]

Отличается этот гормон от двух предыдущих, помимо циклической структуры, тем, что не содержит на М-конце пироглутаминовой кислоты дисульфидная связь образуется между двумя остатками цистеина в 3-м и 14-м положениях. Следует отметить, что синтетический линейный аналог соматостатина также наделен аналогичной биологической активностью, что свидетельствует о несущественности дисульфидного мостика природного гормона. Помимо гипоталамуса, соматостатин продуцируется нейронами центральной и периферической нервных систем, а также синтезируется в 8-клетках панкреатических островков (островков Лангерганса) в поджелудочной железе и клетках кишечника. Он оказывает широкий спектр биологического действия в частности, показано ингибирующее действие на синтез гормона роста в аденогипофизе, а также прямое тормозящее действие его на биосинтез инсулина и глюкагона в 3- и а-клетках островков Лангерганса. [c.254]

Природа предоставила нам редкую возможность установить структуру фермент-субстратных комплексов трипсина и химотрипсина с полипептидами, создав множество ингибиторов-полипептидов, которые очень прочно связываются с трипсином и химотрипсином, поскольку зафиксированы в той конформации, которую субстрат принимает при связывании [52]. Эти полипептиды не гидролизуются при физиологических условиях, так как подвижность аминогруппы, которая высвобождается при расщеплении пептида, ограничена и она не может диффундировать из активного центра фермента. При устранении ограничений в панкреатическом ингибиторе трипсина путем восстановления дисульфидного мостика в полипептидной цепи пептидная связь между Ьуз-15 и А1а-16 легко расщепляется трипсином [53]. Структура трипсина, его комплекса с основным панкреатическим ингибитором трипсина и свободного ингибитора была установлена при разрешении 1,4, 1,9 и 1,7 А соответственно [54]. Полученные данные относятся к числу наиболее точных — положение атомов известно с точностью 0,1—0,2 А. Эти и другие исследования дали следующую информацию относительно связывания субстратов [55—65]. [c.39]

В настоящее время полностью расшифрована аминокислотная последовательность панкреатической рибонуклеазы (она состоит из 124 аминокислотных остатков). Субтилизин гидролизует пептидную связь между 20-м и 21-м аминокислотными остатками рибонуклеазы. Полученный пептид, состоящий из 20 аминокислотных остатков, способен обратимо отделяться от оставшейся части молекулы фермента. Удаление пептида сопровождается утратой активности, а его воссоединение с молекулой — за счет нековалентных связей — приводит к полному восстановлению активности фермента. Далее восстановление четырех дисульфидных связей молекулы рибонуклеазы вызывает полное разворачивание полипептидной цепи фермента. Когда при окислении кислородом дисульфидные связи снова образуются, происходит почти полное восстановление активности фермента. Таким образом, характер складывания полипептидной цепи должен опреде- [c.108]

Важнейшим достижением в изучении механизмов структурной организации белков явились экспериментальные исследования Крейтона 1970-1980-х годов, особенно его работы, посвященные эмпирическому подходу к изучению промежуточных состояний обратимой денатурации цистинсо-держащих белков [29, 30]. Разработанные Крейтоном методы позволяют Идентифицировать дисульфидные связи, регулировать скорость их образования и разрушения и по последовательности возникающих промежуточных MOHO-, ди- и т.д. S-S-продуктов следить за ходом свертывания белковой цепи. Предпринятое им на этой основе исследование пути свертывания панкреатического трипсинового ингибитора [29] опережает и сейчас, по прошествии двух десятилетий, научный уровень аналогичных работ по ренатурации других белков. Подход Крейтона, однако, неприемлем для белков, лишенных S-S-мостиков. [c.86]

Устойчивость к денатурирующим агентам в большой мере зависит от наличия дисульфидных связей в молекуле белка. В ингибиторе трипсина (панкреатический белок) есть три S — S-связи. Если их восстановить, то происходит денатурация без других денатурирующих воздействий. Если затем белок поместить в окислительные условия, в которых происходит окисление SH-групп цистеина и образование дисульфидных связей, то исходная конформация восстанавливается. Даже единственная дисульфидная связь существенно повышает стабильность пространственной структуры. [c.36]

Доказать термодинамическую гипотезу свертывания очень трудно. Обычно полагают, что термодинамическая гипотеза подтверждается экспериментами по повторному свертыванию панкреатической рибонуклеазы [4351. В этих опытах восстановленная несвернутая рибонуклеаза повторно окислялась в присутствии 8 М мочевины причем образовывалась случайная система водородных связей. В результате получалось около 100 различных продуктов, каждый из которых характеризовался своим набором из 4 дисульфидных связей (возможны (2-4) /2 -4 = 105 систем связей S—S [436, 4371 кроме того, существуют различные теоретические возможности образования петель. Удаление мочевины и добавление меркаптоэтанола (рис. 4.3) приводило к постепенному и в конечном счете количественному образованию нативной структуры. Этот факт показывает, что исходя из 100 различных групп, находящихся в исходных конформациях, можно получить нативную структуру. Хотя это число и невелико, данный опыт свидетельствует об уникальности продукта свертывания, однако он не позволяет решить вопрос о локальном или глобальном минимуме. [c.182]

Изучено также пространственное строение панкреатической рибонуклеазы. Наиболее известной особенностью рибонуклеазы является ее способность обратимо восстанавливать нативную пространственную конформацию после разрыва всех 4 дисульфидных мостиков при обработке (3-меркаптоэтанолом и 8 н. раствором мочевины, действующими на водородные связи. После удаления этих реагентов белок повторно свертывается и окисляется, восстанавливая прежние свойства. Более того, фермент остается активным даже после разрыва полипептидной связи между Ala 20 и Ser 21 остатками. Реконструкция осуществляется под влиянием межвитковых взаимодействий боковых заместителей основной полипептидной цепи. [c.115]

На основе экспериментального подхода, объединяющего отмеченные выше и некоторые другие методы, можно проводить изучение денатурации по строго логической и апробированной схеме. Она прежде всего включает получение информации о наличии дисульфидной связи в любом промежугочном продукте, что свидетельствует о сближенности соответствующих участков его полипептидной цепи. Такие данные о серии продуктов, например о моно-8-8-производных, образовавщихся на первом этапе ренатурации, создают о каждом из них специфическое стереохимическое представление. Сопоставление таких (а именно детерминированных числом и положением дисульфидных связей) представлений о всей гамме метастабильных промежуточных продуктов на пути ренатурации от флуктуирующего клубка до нативной трехмерной структуры позволяет выделить ряд связанных между собой продуктивных промежуточных состояний внутримолекулярных конвертируемых реорганизаций, ведущих этот ряд к нативной конформации. Дисульфидная связь как бы делает видимым весь процесс сборки белковой глобулы. В наиболее полной мере имеющиеся возможности реализованы пока лишь для одного белка - бычьего панкреатического трипсинового ингибитора. [c.381]

Исследование процесса ренатурации барназы Ферштом и соавт. [31-33] (как и панкреатического трипсинового и ингибитора Крейтоном [29, 30]) подробно изложено во втором томе издания "Проблема белка" [2. Ч. III]. Анализ результатов привел к заключению, что первая попытка воссоздать на уровне отдельных аминокислотных остатков количественную картину всего пути свертывания белка, не содержащего дисульфидные связи, не достигла желаемой цели. Декларированный Ферштом порядок ренатурации не является неизбежным следствием объективного рассмотрения, а представляет собой один из многих правдоподобных вариантов. Принципиальное возражение заключается в несоответствии равновесной термодинамики и формальной кинетики - теоретической основы эмпирического подхода Фершта - сугубо неравновесному характеру процесса структурной самоорганизации белка. [c.88]

А. Первичная структура белка-ингибитора панкреатического трипсина-из клеток быка. Б. Трехмерная структура белка (ленточная диаграмма). Видны локальные области вторичной структуры (например, спиральные участки с 47-го остатка по 56-й), а также изгибы цепи с образованием третичной структуры, стабилизируемой взаимодействиями между аминокислотами, которые не являются ближайшими соседями вдоль поли-пептидной цепи. Эти взаимодействия осуществляются между остатками цистеина (цветные шарики) с помощью дисульфидных связей. S. Молекулярная модель белка. Ленточная диаграмма на рис. Б представляет собой вид на эту модель снизу. [С любезного разрешения Т.Е. reighton, J. Mol. Biol., 95 (1975), p. 167.] [c.34]

Свертывание может происходить значительно быстрее, чем синтез цепи. Свертывание in vitro осуществляется чрезвычайно быстро, по крайней мере для малых белков, не содержащих дисульфидных мостиков. Нуклеаза стафилококка повторно свертывается в течение 1 с [438], а метмиоглобин — в течение 10 с [439]. Если эти величины применимы также и к условиям in vivo, свертывание цепи может происходить по крайней мере в 10 раз быстрее, чем биосинтез аминокислотной последовательности. Дисульфидсодержащие белки, например панкреатическая рибонуклеаза, повторно свертываются за время от 1 до 10 с, если дисульфидные связи не были разорваны в процессе предшеств ющей денатурации [440]. Однако если такие белки развернуты и восстановлены, последующее свертывание цепи (которое включает образование правильной системы дн-сульфидных связей) продолжается при оптимальных условиях в течение многих минут. [c.182]

Ковалентные промежуточные состояния на пути свертывания бычьего панкреатического трипсинового ингибитора (BPTI) (451, 793]. Обозначения пояснены в тексте. Правильные дисульфидные связи показаны в крайней рамке справа. В промежуточиы.ч состояниях, например Ид и Ilg, правильные дисуль-фидиые связи изображены тем же шрифтом, что и в N-состояиии. Приведенный иа рисунке путь свертывания относится к быстро свертывающимся цепям, т. е. к 85% несвернутых молекул. [c.187]

Важнейшим достижением в познании механизма структурной самоорганизации белковых молекул, явились работы Т. Крейтона 1970— 1980-х годов, особенно посвященные экспериментальному исследованию пути свертывания панкреатического трипсинового ингибитора и созданию общего подхода к анализу процесса обратимой денатурации, цистеинсодержащих белков (гл. 12). Комплекс аналитических методов, как созданных самим Крейтоном, так и известных ранее, позволил надежно идентифицировать дисульфидные связи и управлять процессом их образования и разрушения, что сделало возможным следить за ходом свертывания белковой цепи по промежуточным S—S-продуктам. Разработанный подход, очевидно, неприемлем для белков, лишенных остатков ys или не образующих дисульфидных связей. Кроме того, он не мог быть использован и для более детального исследования самих цистеинсодержащих белков, так как позволяет судить о последовательности образуюпщхся по ходу сборки промежуточных продуктов и [c.384]