Клонирование гибридных генов в плазмидах

Клонирование гибридных генов в плазмидах pUR [c.143]

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78]

Иногда понятия "генная инженерия" и "биотехнология" отождествляются (А А Баев, 1984), хотя несомненно генная инженерия представляет собой один из методов науки биотехнология В основу генноинженерных методов заложена способность ферментов — рестриктаз расщеплять ДНК на отдельные нуклеотидные последовательности, которые могут быть использованы для встраивания их в геномы бактериальных плазмид и фагов с целью получения гибридных, или химерных форм, состоящих из собственной ДНК и дополнительных встроенных фрагментов несвойственной им ДНК Поэтому методами генетической инженерии добиваются клонирования генов, когда выделяют нужный отрезок ДНК из какого-либо биообъекта и затем получают любое количество его, выращивая колонии генетически идентичных клеток, содержащих заданный участок ДНК Другими словами клонирование ДНК — это получение ее генетически идентичных копий [c.179]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

Развитие методов генной инженерии привело к разработке системы трансформации для дрожжей, что способствовало более глубокому изучению у них механизма рекомбинации. Гибридные плазмиды, содержащие участки дрожжевой ДНК с известными маркерами, клонированные на векторе Е. соИ, могут быть введены в клетки дрожжей. При этом может происходить встраивание плазмидной ДНК в хозяйскую хромосому за счет рекомбинации между гомологичными последовательностями хромосомы и участка дрожжевой ДНК, входящего в состав плазмиды. При использовании плазмидной ДНК в замкнутой кольцевой форме удается с заметной частотой отобрать трансформированные дрожжевые клетки. В то же время введение двухцепочечного разрыва в дрожжевую [c.150]

За последние годы в селекции продуцентов аминокислот активно начали использовать методы генной инженерии, позволяющие повышать дозу генов биосинтеза аминокислот путем их клонирования на плазмидах. Трансформируя гибридные плазмиды в клетки, удается повысить дозу генов и, следовательно, количество ферментов, ответственных за биосинтез соответствующей аминокислоты. [c.21]

Основной недостаток методов фенотипического выявления гибридных клонов плазмид и вирусов заключается в том, что с их помощью не удается отобрать гибриды, содержащие специфические последовательности ДНК. Последние можно легко выявить методами гибридизации нуклеиновых кислот in situ в колониях трансформированных клеток или в бляшках вирусов. Эти процедуры начиная с 1975 г. интенсивно совершенствовались, и в настоящее время они достаточно просты и активно используются в работах по клонированию генов. [c.34]

Е. соИ с Тс на Тс ". Во многом аналогично сконструированы плазмиды Е. соИ, содержащие ген хлорамфениколацетилтрансферазы ( at), у которого делетирован промотор, но сохранена структурная часть. Эти плазмиды также обеспечивают возможность клонирования последовательностей ДНК, которые в клетках Е. соИ функционируют как промоторы. По степени устойчивости к антибиотику, детерминируемой гибридными промоторсодержащими плазмидами, можно осуществлять косвенную оценку эффективности функционирования отобранных промоторов. [c.97]

Клонированный в составе плазмиды ген тимидинкиназы вируса простого герпеса был использован при разработке нового подхода к конструированию гибридных вирусов, которые имеют крупный геном и вследствие этого к ним неприменимы методы рекомбинации молекул ДНК in vitro. Б. Ройзман с сотрудниками в 1978-1979 гг. показали, что при совместной трансфекции клеток молекулами ДНК штамма HSV-1, имеющего термочувствительную мутацию, и определенным рестрикционным фрагментом ДНК вируса дикого типа удается осуществить так называемое спасение маркера. Оно происходит при рекомбинации in vivo фрагмента вирусного генома с мутантной ДНК вируса, в результате чего мутантный локус замещается локусом дикого типа. [c.386]

Данное наблюдение позволило разработать методологию эффективной интеграции любых генов в различные области генома эмбрионов дрозофилы. Во внутреннюю область Р-элемента, клонированного в бактериальной плазмиде, встраивается фрагмент чужеродной ДНК. Полученная гибридная плазмида, у которой в результате встройки нарушается ген транспозазы Р-элемента, инъецируется в эмбрионы дрозофилы совместно с исходной плазмидой, несущей нативный Р-элемент, который выполняет функции помощника транспозиции. Выжившие эмбрионы анализируют на наличие в хромосомах интегрированных копий гибридных Р-элементов. Оказалось, что 20-25% таких эмбрионов могут содержать чужеродную ДНК, интегрированную в составе гибридного элемента. Причем интеграция происходит в разные хромосомы и в различные участки одних и тех же хромосом. Нативный и дефектный гибридный [c.430]

Подавляющее большинство вирусов растений являются вирусами с одноцепочечной РНК и реплицируются в цитоплазме клетки. Вирусы в растениях накапливаются до высоких концентраций, поэтому заманчиво использовать их в качестве многокопийных экспрессирующих векторов. При этом генно-инженерные манипуляции по встройке целевых последовательностей в вирусный геном осуществляют на клонированных в бактериальных плазмидах ДНК-ко-пиях вирусных РНК. ДНК-копию в плазмиде встраивают между промотором и терминатором транскрипции фага (например Т7). С помощью фаговой РНК-полимеразы in vitro синтезируют РНК-транскрипты гибридных ДНК и трансфицируют ими протопласты или ткани растения. [c.475]

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в . соН, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид Е. соИ и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим отбором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем вьщеленные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хозя-ину легко тестируемый признак. [c.124]

Обычно векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, которые мог т существовать и в Е. OU. и в той клетке-хозяине. для которой они предназначены. Это достигается созданием гибридных векторов, содержащих реп-ликон какой-либо из плазмид Е. oli и требуемый репликон, например плазмиды В. subtilis или дрожжей, что позволяет проводить первоначальное клонирование и отбор требуемых генов в хорошо изученной системе Е. oli, а затем уже вводить выделенные рекомбинантные плазмиды в новый организм. [c.439]

Этот ПОДХОД был использован при клонировании гена соматостатина-пт-тщного гормона (14 аминокислотных остатков) из гипоталамуса, регулирующего секрецию инсулина, глюкагона и гормона роста. Ген соматостатина был в этом случае синтезирован химически и присоединен к концу гена 3-галактози-дазы. Два связанных между собой гена были встроены в плазмиду Е. соИ, и полученная рекомбинантная плазмида была введена в клетки Е. oli. В результате такие клетки синтезировали большие количества гибридного белка, состоящего из ковалентно соединенных друг с другом Р-галактозидазы и соматостатина. Такая молекула, представляющая собой гибрид собственного белка Е. oli и белка позвоночного организма, называется химерным белком. Гибрид р-галактозидазы и соматостатина расщепляли по пептидной связи, соединяющей два белка, что приводило к освобождению обладающего биологической активностью соматостатина. [c.988]

В этот вектор также вставлен межгенный район однонитевого фага М13. При лизисе клеток, содержащих такую гибридную плазмиду (фазмиду), и суперинфицированных специальным фагом-помощником М13, образуются гибридные однонитевые ДНК в высоком титре (и в том числе клонированный ген), которые могут быть использованы для определения последовательности оснований. Преимущество такой конструкции перед фагом [c.153]

В том случае, когда ожидается с высокой вероятностью экспрессия клонированного гена, методы скрининга рекомбинантных клонов основываются либо на изменении фенотипа клетки под влиянием вновь синтезированного белка, либо просто на свойствах самого белка. Например, если необходимо изолировать гены Е. соИ, ответственные за биосинтез какой-либо аминокислоты, то отбирают рекомбинантные клоны, трансформируя гибридные плазмиды в ауксотрофные по биосинтезу аминокислот мутанты и получая прототрофные клоны. Это и есть тест на комплем 1и тацию. Прием очень удобный, но он исполь зуетея-ТУбычнопри самоклонировании , т. е. при переносе генов на многокопийных плазмидах в тот же микроорганизм, и требует наличия штаммов с хорошо охарактеризованными мутациями искомых генов. [c.154]

С появлением методологии генной инженерии метод локализованного мутагенеза становится доступным для широкого круга микроорганизмов. В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что сильно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина (см. гл. 4). Для получения стабильных неревер-тирующих мутаций в определенном гене можно применить метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминант устойчивости к антибиотику (рис. 29). Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащей указанный детерминант, фланкированный последовательностями, гомологичными хромосомному гену. В результате двойного кроссинговера происходит интеграция гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на селективных [c.160]

Во-первых, реципиентный штамм должен быть хорошо трансформируемым штаммом, генетическая структура которого позволяет легко отбирать трансформанты, несущие гибридную плазмиду с требуемыми генами. Для этого реципиентный штамм должен иметь мутацию на хромосоме, которая повреждает один из генов, клонированных на гибридной плазмиде. В случае клонирования треонинового оперона целесообразно введение в реиипиент-ные клетки мутации thr В или thr С. [c.187]

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов (генных зондов), являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК—ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетических свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее выбранный фрагмент ДНК с помощью фермента лигазы вводят в состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную-плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (например, Es heri hia соН). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом ауторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом. [c.197]

Выходы интерферона с клонированных генов, введенных в клетки млекопитающих невысоки в лучшем случае они достигают 10 ед. на 1 мл в день, что значительно меньше количества, получаемого с собственными клеточными генами интерферона. Основным преимуществом при синтезе интерферона с клонированных генов является смена промоторов. В норме интерфероновые гены находятся под контролем элементов, которые могут быть включены только при помощи деструктивных индукторов и вирусная инфекция, и ро1у(1С) обычно убивают клетки, поэтому интерферон может синтезироваться только в течение непродолжительного времени (обычно меньше, чем 48 ч). Однако, когда Хэршес и Вайсман [94] ввели полученные ими dhfr-содержащие гибридные плазмиды в клетки СНО и вели селекцию в среде, содержащей метотрексат, им удалось выделить клоны, содержащие множественные копии плазмиды, которые продуцировали от 20 000 до 100 000 ед. интерферона на [c.46]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонирование гибридных генов в плазмидах: [c.143] [c.377] [c.134] [c.174] [c.136] [c.193] [c.311] [c.313] [c.315] [c.403] [c.60] [c.61] [c.74] [c.62] [c.139] [c.202] [c.211] [c.166] [c.171] [c.172] [c.186] [c.191] [c.198] [c.281] [c.134] [c.103] [c.190] [c.85] [c.88] [c.96]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология