Электрофорез в градиенте плотности

Электрофорез в градиенте плотности. В качестве среды используют жидкость, стабилизированную добавлением глицерина, гликолей или сахарозы, создающих градиент плотности. Этой жидкостью, более тяжелой, чем фракционируемый раствор, заполняют внутреннюю трубку стеклянной охлаждаемой колонки. Дно трубки закрыто пористой стеклянной пластинкой. К обоим концам колонки присоединяют два электродных сосуда и проводят электрофорез. [c.145]

Зональный электрофорез в градиенте плотности................65 [c.40]

Зональный электрофорез в градиенте плотности [c.65]

Этот метод возник позднее других. Его развитие началось менее 10 лет назад и связано в основном с именами Колина и Свенсона. И в настоящее время метод не получил еще такого широкого распространения, какого несомненно заслуживает. Накопленный опыт пока невелик тем не менее он показывает перспективность применения электрофореза в градиенте плотности в самых различных областях и возможности его дальнейшего усовершенствования. Подробные обзоры были опубликованы Колином [13] и Свенсоном [14]. [c.65]

Электрофорез в градиенте плотности сочетает в себе многие преимущества как фронтального метода, так и зонального электрофореза на инертном носителе, и в то же время не имеет некоторых их недостатков. В градиенте плотности можно разделять как крайне малые, так и значительные количества вещества. В первом случае особенно важно отсутствие опасности адсорбции, которой невозможно избежать, если применяется твердый носитель. Применяя для анализа радиоактивную метку или измерения биологической активности, можно работать с субмикрограммовыми количествами вещества. Метод вполне пригоден для разделения низкомолекулярных веществ. [c.66]

Рис. 10. Прибор для электрофореза в градиенте плотности.

Выше были описаны только основные электрофоретические методы. Кроме них, существует огромное множество их модификаций, приспособленных для специальных целей препаративного разделения в растворе, разделения микроколичеств вещества на ацетат-целлюлозных волокнах, непрерывный электрофорез, электрофорез в сочетании с хроматографией и т. д. Электрофорез является очень щадящим методом на его результаты сравнительно слабо влияют неконтролируемые изменения условий разделения pH, температуры, ионной силы раствора растворы разделяемых веществ практически не разбавляются. Несомненно, что метод находится еще в стадии развития. Особенно это относится к электрофорезу в градиенте плотности и в гелях. [c.106]

Дискретный электрофорез Многофазный зонный электрофорез Электрофорез в градиенте плотности полиакриламидного геля (электрофорез, определяемый размером пор) [c.282]

Рис. 3.8. Схема типичного прибора для препаративного электрофореза в градиенте плотности.

В среде, содержащей мочевину, на целлюлозных колонках, что позволило выделить электрофоретические фракции в значительных количествах. Зональный электрофорез в градиенте плотности применил Мансон [34] для предварительного фракционирования казеинового комплекса. [c.42]

На рис. 9 изображен прибор для зонального электрофореза в градиенте плотности [985]. Основной его частью является J-образная трубка, основание которой заполнено пробкой из полиакриламидного геля. В коротком колене трубки над пробкой геля находится насыщенный раствор хлористого натрия, в который погружен один из электродов. В длинном колене поверх трубки помещают слой забуференного насыщенного раствора сахарозы, а остальную часть этого колена используют как градиентную колонку. Для ее заполнения и опорожнения служит поршень, соединенный с градиентным смесителем или коллектором фракций при помощи гибкого пластмассового шланга. Кроме того, в поршне просверлены отверстия, которые заполняют забуференным полиакриламидным или агарозным гелем для обеспечения электрического контакта с на- [c.30]

При использовании градиента плотности для стабилизации зон в ходе ИЭФ можно применять те же или аналогичные приборы, которые предназначены для зонального электрофореза в градиенте плотности. Основная трудность при их конструировании состоит в том, что в процессе электролиза на электродах образуются пузырьки газа, мешающие нормальному разделению анализируемых веществ. Для преодоления этой трудности существуют два способа электроды пространственно отделяют от остальной части прибора или изготавливают их из специальных сплавов благородных металлов, на которых пузырьки газа не образуются. В этой главе будет описано несколько аппаратов обоих типов, употребляемых при ИЭФ. [c.131]

Метод движущейся границы (фронтальный электрофорез) непригоден для препаративного фракционирования. Для этого более удобен и эффективен метод так называемого зонального электрофореза и различные его модификации, При зональном электрофорезе конвекционное перемешивание предотвращается с помощью градиента плот-ности (сахароза, глюкоза)—электрофорез в градиенте плотности и при помощи инертных носителей (агароза, сефадекс, полиакриламид) — электрофорез в поддерживающих средах. [c.25]

Метод зонального электрофореза в градиенте плотности и в гелях описан в ряде работ [83, 535, 536, 802]. [c.25]

Электрофорез в градиенте плотности [c.45]

Важное значение имеет также плотность исследуемого раствора. Она должна быть равной или по крайней мере близкой к плотности ореды в месте его введения. В связи с тем что измерение плотностей жидкостей в малых объемах является трудоемкой процедурой, для создания условий, при которых исследуемый раствор и среда будут иметь одинаковую плотность,, применяются более простые методы. Свенссон и др. [1265] предложили в месте введения пробы создавать уступ плотности — крутой локальный градиент плотности. В этом случае достигается хорошее приближение к идеальной плотности пробы, так как она может быть любой в пределах плотностей верхнего и нижнего краев уступа . Обычно формирование слоя исследуемой пробы проходит успешно, если градиент плотности в месте ее внесения настолько крут, что расстояние между этим местом и слоем, имеющим одинаковую с пробой плотность, не превышает нескольких миллиметров. В этом случае раствор пробы почти лэминарно перемещается вверх или вниз до уровня равной с ним плотности и образует тонкую горизонтальную полосу. Если же градиент плотности слишком пологий и (или) расстояние между местом внесения пробы и слоем с равной плотностью велико, то перемещение пробы вплоть до достижения ею этого слоя будет сопровождаться конвекционными токами, ухудшающими качество стартовой зоны. Поскольку при электрофорезе в градиенте плотности в отличие от изоэлектрического фокусирования толщина стартовой зоны существенно влияет на качество разделения, правильное внесение пробы имеет исключительно важное значение. [c.27]

Для проведения зонального электрофореза в градиенте плотности были разработаны приборы разных типов. Сведения о приборах, предложенных в начальном периоде применения этого метода, содержатся в обзорах Колина [703] и Свенссона [1259]. Ниже будут описаны лишь екоторые другие типы приборов. [c.29]

Специальный прибор для электрофореза в градиенте плотности был сконструирован Свенссоном и др. [1259, 1264, 1265]. Электрофорез проводится в вертикальной стеклянной колонке, снабженной охлаждающей рубашкой для достижения хорошего термостатирования. Платииовые электроды помещают в боковые трубки, одна из которых при помощи жидкостного контакта соединяется с нижней, а другая — с верхней частью разделительной колонки. Применение отдельных электродных сосудов позволяет удалять пузырьки газа, не нарушая градиента плотности. Фракционирование градиента после проведения разделения осуществляется через капиллярную трубку, введенную в нижнюю часть колонки. Для заполнения колонки градиентом и для внесения исследуемого образца используется дополнительный сосуд, работающий по принципу Мариотта. Описанное устройство было слегка модифицировано Чарлвудом и Гордоном >[222]. [c.29]

Рис. 9. Прибор для электрофореза в градиенте) плотности в начале электрофоретического разделения [985]. А, Л-образная трубка. Б. Составные части поршня. 1 — аппарат для создания градиента плотности 2 — двухходовой кран 5 —трехходовой кран — пластмассовый шприц для вне сения пробы 5 — пропускание воздуха для перемешивания раствора при формировании градиента 6 — ось редуктора, понижающего число оборотов мотора 7—нитка 8 — анодная платиновая спираль Р —градиент —поршень /7 —проба в выбранном положении /2 — насыщенный раствор сахарозы 75 —пробка из полиакриламидного геля 74 — насыщенный раствор хлористого натрия /5 — катод 75 —водяная рубашка для термостатировання 77—пластмассовая трубка 75 —зубчатая насечка 7Р —пробка из полиакриламида или агарозы 20 — уплотнительное кольцо 21 — наконечник для присоединения пластмассовой трубки.

Как уже отмечалось, качество разделения при проведении электрофореза в градиенте плотности сахарозы зависит от толщины стартовой зоны, которая в свою очередь определяется конструкцией аппарата и способом введения пробы. Однако даже в идеальных условиях стартовая зона, как правило, составляет несколько миллиметров, и в целях повышения разрешающей силы электрофореза ее желательно уменьшить. Принцип диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет создавать очень тонкие стартовые зоны путем концентрирования белков, находящихся в исследуемом растворе. Именно поэтому он дает более эффективное разделение по сравнению с зональным электрофорезом в градиенте плотности. С другой стороны, извлечение белков из узких зон в полиакриламидном геле сложнее, чем из растворов с градиентом плотности. Процедура, сочетающая преимущества обоих методов, позволяет получать узкие стартовые зоны и легко выделять разделившиеся вещества из градиента плотности. Шастер и Шрир [1150] описали очень простой прибор для практического воплощения этой идеи. Электрофорез проводили в U-образной трубке. В обоих ее коленах над колонкой с градиентом плотности помещали слой полиакриламидного геля. Зоны, разделенные в геле, мигрировали затем в градиент плотности, где расширялись не более чем в 2—3 раза по сравнению с их толщиной в геле. Эта установка отличается довольно большой емкостью за один прием авторам удалось разделить 50 мг бычьего сывороточного альбумина, и, по их мнению, емкость должна быть еще больше при разделении более сложной смеси белков. [c.32]

Рис. 56. Схематическое изображение колонки для электрофореза в градиенте плотности (фирма IS O модель 210) [464, 465]. Упрощенный вариант, который можно использовать также и для изоэлектрофокусирования. 1 — съемная крышечка для введения градиентного раствора и образца 2— выходная трубка для охлаждающей жидкости 5 —шкала в сантиметрах 4 —полупроницаемые мембраны 5 — верхние электродные сосуды 6 — центральная тефлоновая трубка (внутренний диаметр 1 см) 7—кварцевые окошки 8 — измеритель УФ-света Р —трубка для охлаждающей жидкости 10—шжтл электродные сосуды 11 —шприц, приводимый в движение электромотором

Так как арбовирусы очень лабильны, то для очистки и концентрирования их используют мягкие методы осаждение иротаминсульфатом и полиэтиленгликолем, обработка в двухфазных полимерных системах, хроматография на фосфате кальция и электрофорез в градиенте плотности. Но наиболее широкое применение, особенно на заключительном этапе очистки, нашли методы зонального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и равновесное центрифугирование в хлористом цезии. [c.8]

Третий физический метод — электрофорез, не получил такого широкого распространения в исследовании вирусов, как ультрацентрифугирование. Классический метод Тизелиуса (фронтальный электрофорез) для очистки и фракционирования вирусов непри-годен. Более удобен зональный электрофорез в градиенте плотности, предложенный в 1953 г. Брекком [217]. Для препаративной очистки вирусов животных этот метод стали применять с 1958 г. после работ Крамера с сотр. [271]. Очень широкое распространение для фракционирования белков и нуклеиновых кислот получил метод дискового электрофореза в полиакриламидном геле, предложенный в 1962 г, Рейсфельдом с сотр, [684]. [c.44]

Принципы метода электрофореза и некоторое применение его при физическом исследовании вирусных частиц были описаны в разделе Физические методы исследования вирусных частиц . Электрофорез применяют также для очистки вирусов. Так, Брекк [218] в 1955 г применил метод зонального электрофореза в градиенте плотности сахарозы для очистки вируса желтой мозаики картофеля, а Крамер и Полсон [271] ддя очистки вирусов животных. Он был успешно использован для очистки вируса энцефалита мышей [224], полиомиелита [650], энтеровирусов человека 652], вируса лихорадки долины Ряфт 503] и вируса 5GB0 [655]. Однако этот очень ценный метод не нашел еще широкого применения в вирусологической практике, по-видимому, из-за некоторых технических трудностей. [c.85]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология