Клонирующие плазмидные векторы

Векторы на основе бактериофага Л С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек час- [c.71]

Емкость клонирующих векторов была значительно повышена с появлением векторов, сконструированных на основе хромосомы бактериофага X. Получившие широкое распространение векторы серий haron, Xgtll и XBMBL обладают, по крайней мере, двумя существенными преимуществами перед плазмидными векторами. Во-первых, векторы на основе ДНК фага X обладают значительно большей емкостью, в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 5 до 25 т.п.о. Во-вторых, фаговые частицы, содержащие упакованную ДНК, способны проходить литический цикл развития внутри бактериальных клеток и поэтому образовывать стерильные пятна (бляшки) на газоне бактерий. Такие бляшки содержат в концентрированном виде как сами фаговые [c.80]

К моменту появления методологии генетической инженерии колифаг Я по сравнению с другими вирусами бактерий был наиболее полно изучен генетически и молекулярно-биологически. Это и обусловило то, что наряду с плазмидными векторами уже в 1974 г. появилась серия клонирующих векторов на основе фага Я. [c.97]

Клонирующие плазмидные векторы [c.85]

Фаговые векторы. Космиды. ВАС- и YA -векторы. Векторы на основе бактериальных плазмид широко используются для клонирования, но у них есть один важный недостаток — небольшая емкость. В таких векторах можно клонировать фрагменты в среднем не более 7—8 т. н. п., а последовательности эукариотических генов гораздо длиннее (в среднем IО—25 т. н. п). Кроме того, для изучения регуляторных последовательностей, находящихся за пределами кодирующей части генов, необходимо клонировать еще более протяженные области генома. Оказалось, что для клонирования таких фрагментов плазмидные векторы не подходят. Дело в том, что плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК (более 8 т. н. п.), нестабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в результате делеций нуклеотидов чужеродной ДНК. [c.40]

Фрагмент ДНК, тестируемый на мутации или полиморфизм, необходимо клонировать в плазмидном векторе, позволяющем синтезировать определенные типы зондов (обычно одноцепочечные РНК- или ДНК-зонды). Некоторые из векторов описаны в разд. 5.1 и 6.3. [c.141]

При конструировании гибридов на основе векторных молекул ДНК фага А или фагов серии М1 Зтр удается осуществлять прямой отбор клонов гибридных фагов. В случае же использования плазмидных векторов прямой отбор клеток, содержащих гибридные плазмиды, часто невозможен. Поэтому возникла необходимость в разработке векторных плазмид с системой прямой селекции гибридных вариантов. Предпринятые исследования привели к созданию широкого спектра таких клонирующих векторов некоторые из них мы рассмотрим. [c.118]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

В настоящее время гены РНК- или ДНК-содержащих вирусов легко клонируются в клетках прокариот при использовании плазмидного или фагового вектора. Клонированная вирус- [c.154]

Плазмиды-небольшие элементы бактерий, реплици-руюшиеся независимо от бактериальной хромосомы (гл. 31). Геном плазмид всегда представляет собой кольцевую двухцепочечную ДНК и имеет систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Сушествует два основных типа плазмид. В случае однокопийных плазмид на хромосому клетки-хозяина приходится 1 молекула плазмидной ДНК. Мультикопийные плазмиды присутствуют в клетке в большем количестве, обычно состав-ляюшем около 10-20 плазмидных геномов на клетку. Некоторые плазмиды находятся под ослабленным контролем репликации, в результате чего при прекрашении роста бактерий они накапливаются в очень больших количествах ( 1000 плазмидных геномов на клетку). Такие плазмиды часто используют для получения клонирующих векторов, поскольку они обеспечивают более высокий выход материала. [c.237]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

На данном этапе фаговый или плазмидный вектор вводят в бактериальную клетку, в которой он сможет размножаться (клонировать себя и чужеродную донорную ДНК, которую он содержит). Как правило, для этих целей используют бактерию Es heri hia oli — обычного обитателя кишечника человека. Кишечная палочка выбрана для этой цели потому, что генетика этой бакте- [c.223]

Клонирование всего генома (в противоположность клонированию специфических фрагментов) часто называют шотган -экспериментами (shotgun experiment-метод дробовика). Для их осуществления весь геном разделяют на фрагменты удобного размера. Затем фрагменты встраивают в клонирующий вектор с образованием популяции химерных векторов. Набор таких клонированных фрагментов называют библиотекой генома. Библиотека, однажды полученная с помощью фагового или плазмидного вектора (чаще-фагового вектора, поскольку в таком виде легче хранить необходимые большие количества химерных ДНК), может храниться неограниченно долгое время и при появлении нового зонда быстро может быть использована для поиска специфического фрагмента. [c.243]

Ген металлотионеина представляет собой еще один амплифицируемый маркер, работа с которым подробно освещена в данной главе. Особенно хорошо изучен один из двух генов мыши m-mtl, этот ген невелик, и его геномную копию удобно клонировать в плазмидных векторах [8]. Попытки использовать данный ген в качестве доминантного селективного маркера окончились неудачей (кроме векторов на основе ВРУ [19]). Поэтому для первичной селекции требуется дополнительный маркерньп ген. Эти недостатки компенсируются в ряде случаев простым и недорогим методом селекции клеток на амплификацию мышиного гена rn-mtl, хотя число копий на клетку в этой системе не превышает 100. [c.244]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

Двунитевую кДНК с тупыми концами клонируют в подходящем плазмидном векторе (например, pBR322) либо с помощью G С-коннекторов [31], либо с помощью содержащих рестрикционные сайты линкеров [32]. [c.220]

В специальную группу можно также выделить нуклеотидные последовательности ранних и других районов аденовирусов, папова-вирусов и герпесвирусов, которые клонированы в составе различных плазмидных векторов и обладают трансформирующим действием. Эти гены способны заменять по своему функциональному действию онкогены как ядерного , так и неядерного типа при тестировании их трансформирующей способности по комплементации с клеточными онкогенами при котрансформации нормальных клеток. [c.226]

Кодирующий ген можно клонировать в мультикопийные плазмидные векторы. Тогда клетка может содержать до 50 копий таких плазмид, следовательно, представляющий интерес ген будет присутствовать в ней в большом числе копий и может произвести большее количество требуемого продукта. [c.96]

Плазмида pBR322 оказалась настолько хорошим клонирующим вектором, что в течение ряда лет она использовалась в подавляющем большинстве генно-инженерных работ, в которых применялись плазмидные векторы. Кроме того, на основе плазмиды pBR322 получены другие векторные производные. [c.90]

Космиды — это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага Я, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Необходимыми компонентами космидного клонирующего вектора являются [c.105]

Когда используются фаговые векторы, жизнеспособным продуктом, содержащим сконструированную рекомбинантную ДНК, является популяция фаговых частиц. В отличие от ситуации с плазмидными векторами, когда производятся клонирование и отбор содержащих их клеток, рекомбинантный фаговый геном можно клонировать непосредственно. Нри таком клонировании образуются блящки на газоне чувствительных клеток-хозяев (рис. 11.13). Фрагменты чужеродной ДНК, встроенные в популяцию фаговых векторных ДНК in vitro, и соответствующие рекомбинантные фаговые геномы можно затем ввести в клетки пермиссивного хозяина в виде изолированной ДНК (трансфекция) или реконструированных вирусных частиц (инфекция). В любом случае в клетте, инфицированной одной молекулой [c.237]

Фенотипический отбор. Фенотипический отбор из популяции трансформированных оеток-это самый прямой путь вьщеления нужного клона (рис. 628). На практике этот метод, вообще говоря, Офаничивается клонированием прокариотических генов и некоторых генов дрожжей и других фи-бов в клетках прокариот и эукариотических генов в оетках эукариот. В общем виде он был описан в разд. 5.6.6, когда мы рассматривали способ конструирования дрожжевого плазмидного вектора. Чтобы клонировать ген А (или г ЦНК-А), смесь фрагментов ДНК (т.е. фрагментов, полученных из всего клеточного генома) встраивали в векторные молекулы и трансфицировали ими оетки, мутантные по гену А (А"). Клетки выращивали в условиях, требующих присутствия продукта гена А, так что колонии могли образовывать лищь те клетки, в которых синтезируется продукт гена А, присутствующего в векторе. Наиболее подходящими для проведения такого отбора являются клет-ки-хозяева, в которых делетирован либо весь ген А, либо его часть. В противном случае приходится выявлять и разграничивать ревертанты и трансфор- [c.299]

Генетическая селекция in vivo может обеспечить способность организма к разложению специфического вещества. Однако подобные методики нуждаются в длительном периоде селекции (8—10 мес, как описано выше) и основываются на случайном наборе генетического материала для получения желаемой катаболической системы. Использование методов рекомбинантной ДНК дает экспериментатору возможность соединять вместе определенные катаболические последовательности и контролировать экспрессию специфических генов. Уровень экспрессии, определяемый in vivo, зависит от регуляторных механизмов, кодируемых плазмидными последовательностями, и мало что можно сделать, чтобы повлиять на выход отдельных ферментов. Однако можно получить повышенный уровень генного продукта, клонируя определенные гены в векторах по направлению транскрипции промоторных последовательностей. [c.334]

Для секвенирования ДНК по методу Сэнгера ее клонируют в однонитевых фагах. Основа метода Сэнгера — синтез радиоактивных копий однонитевой ДНК от фиксированного олигонуклеотида-затравки в присутствии нуклеотидспецифичных терминаторов синтеза ДНК. Чтобы облегчить выделение однонитевых матриц, Дж. Мессингом сконструирована серия векторов на основе фага М13, содержащего в капсидах однонитевую ДНК. Биология размножения М13 чрезвычайно удобна для создания таких векторов. М13 реплицируется в клетке в виде двунитевой репликативной формы, которую можно легко выделить и использовать для клонирования чужеродной ДНК как обычную плазмидную ДНК. В то же время такие рекомбинантные клоны выделяют и из суспензии зрелых частиц фага в однонитевой форме. Сконструированные Мессингом векторы содержат полилинкер, т. е. последовательность, являющуюся мишенью для нескольких рестриктаз, для клонирования ДНК в области фагового генома несущественной для его размножения кроме того, при вставках чужеродной ДНК изменяется цвет фаговых негативных колоний (пятен лизиса на газоне бактериальной культуры) на среде с индикаторным красителем. Для секвенирования олигонуклеотид- [c.285]

С учетом вышеперечисленных механизмов удалось получить мутантные миниплазмидные производные плазмиды R1 с нарушенным контролем числа копий. Такие миниплазмиды обладают температурочувствительными репликонами, которые при 30°С обеспечивают их существование в виде 20-50 копий на клетку, а при повышении температуры сверх пермиссивной и инкубации клеток на питательной среде в течение 2-3 ч количество плазмидной ДНК достигает 70% от суммарной клеточной ДНК [99]. Векторы, сконструированные на основе таких плазмид, способны обеспечивать очень высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков, гены которых клонированы с их помощью. Повышение числа внутриклеточных копий плазмид в ряде случаев может быть достигнуто и другим распространенным способом. Как уже упоминалось, репликация многих плазмид, в том числе olEl, не требует синтеза белков, кодируемых их генами, тогда как контроль числа копий зависит от синтеза плазмидных макромолекул. Инкубация клеток, содержащих такие плазмиды, с [c.70]

Космиды. Как уже отмечалось, емкость векторов, полученных на базе ДНК фага А, (не более 23 т.п.н.), ограничена тем, что существенную их часть составляют гены, кодирующие структурные белки фага. Как выяснилось, в головку этого фага может упаковаться любая ДНК подходящего размера (36—52 т.п.н.), ограниченная двумя со5-сайтами, ориентированными в одном направлении. Это позволило, совместив в одном геноме плазмидный репликатор и os-сайт фага X, создать векторы нового типа, так называемые космиды ( ollins, Hohn, 1978). Размер космид в среднем составляет 5 т.п.н., что позволяет с их помощью клонировать ДНК размером до 45-47 т.п.н. Поэтому космиды предназначены для конструирования банков генов. [c.217]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонирующие плазмидные векторы: [c.300] [c.390] [c.57] [c.169] [c.169] [c.194] [c.200] [c.238] [c.403] [c.93] [c.360] [c.44] [c.243] [c.245] [c.232] [c.256] [c.74] [c.299] [c.550] [c.145] [c.145] [c.223]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология