Клонированная ДНК, получение

Рис. 4.1. Клонирование рекомбинантной ДНК. Донор-ную ДНК расщепляют рестрицирующей эндонуклеазой и встраивают в клонирующий вектор. Полученную конструкцию вводят в попу ляцию клеток-хозяев, идентифицируют те клетки, которые содержат рекомбинантную ДНК, и культивируют их. При необходимости можно индуцировать экспрессию клонированного гена в клет-ках-хозяевах и получить кодируемый им белок.

С помощью современных генетических методов биологи научились превращать бактерии в своеобразные биологические фабрики по производству белковых препаратов (например, рестрицирующих эндонуклеаз), различных химических соединений, аминокислот, антибиотиков и т. д. Клонируя в бактериальных клетках специфические гены, они создают новые пути биосинтеза для получения уникальных метаболитов, применяют клонированные гены болезнетворных микроорганизмов в качестве зондов для диагностики заболеваний человека и домашних животных, используют изолированные гены для получения безопасных и эффективных вакцин. [c.179]

Улавливание экзонов ( поимка экзонов, эк-зонная амплификация) — это метод, позволяющий идентифицировать и клонировать экзоны, находящиеся в субклонах, полученных из геномных клонов (рис. 20.29). Его суть состоит в [c.474]

Чтобы обеспечить надежный, удобный и по возможности наиболее дешевый промышленный способ получения химозина, кодирующий его ген клонировали и экспрессировали в Е. соИ К-12. Готовый продукт был вьщелен из бактериальных клеток, и в FDA направлена просьба дать разрешение на коммерческое использование рекомбинантного химозина для промышленного производства сыров. Перед FDA встал вопрос какие критерии использовать в этом случае Поскольку применение сычужного фермента, содержащего химозин, в сыроваренной промышленности имеет долгую историю, FDA резонно заключила, что если рекомбинантный химозин идентичен природному ферменту, то дополнительное тестирование проводить не обязательно. По существу лицо, запрашивающее разрешение, должно было лишь подтвер- [c.520]

По мере развития методов репродуктивной биологии млекопитающих и создания различных трансгенных животных становилось все более очевидным, что клонирование человека - дело не столь отдаленного будущего. Предположение стало реальностью в 1997 г., когда была клонирована овечка, названная Долли. Для этого использовалось ядро дифференцированной клетки донорной суягной овцы. Методический подход, который использовался при создании Долли, в принципе пригоден для получения клонов любых млекопитающих, в том числе и человека. И даже если он не оправдает себя применительно к млекопитающим других видов, по-видимому, не потребуется слишком много экспериментов, чтобы разработать подходящий метод. В результате клонирование человека тотчас станет предметом любой дискуссии, затрагивающей этические проблемы генетики и биологической медицины. [c.530]

Клетки можно культивировать либо после извлечения из органа при перфузии, например коллагеназой, либо клонированием, т. е. воспроизводством единичной клетки. Первый метод все еще не дал удовлетворительных результатов. Получение клеточных линий из единичных нервных клеток оказалось очень, успешным [10]. Такие клеточные линии и опухолевые клетки возникают только из клеток на ранней стадии развития, поскольку зрелые дифференцированные нейроны не делятся. В частности, клетка нейробластомы опухоли мыши (С 1300), открытая в 1940 г. и затем воспроизведенная как перевиваемая опухоль, была клонирована в 1969 г. и с тех пор стала классической модельной системой. [c.368]

Рассмотрим теперь более подробно, каким образом гены выделяют, вводят в клетки-хозяева, клонируют и осуществляют трансляцию с целью получения тех или иных продуктов. Слово клон имеет греческое происхождение и означает побег или черенок, применяемый для размножения растения. Оно используется в двух смыслах. Во-первых, под термином клонирование клеток понимают образование группы генетически идентичных клеток, развившихся из одной клетки, как это имеет место в случае линии иммуноцитов, настроенных на синтез определенного типа антител. Под термином же молекулярное клонирование или клонирование генов имеют в виду образование множества идентичных копий гена, полученных в результате репликации одного гена, введенного в клетку-хозяина. [c.983]

Клонирование фрагментов, полученных путем механического дробления, сопряжено с рядом технических трудностей в вектор легче встроить рестрикт. Однако сложность такого встраивания состоит в том, что сайты рестрикции могут находиться в неудобных местах, например в середине гена, который надо клонировать. Один из способов преодоления этой трудности состоит в использовании более чем одной рестриктазы, т.е. в повторении эксперимента с различными ферментами, сайты узнавания которых занимают разные положения. Но это требует дополнительного времени, и при работе с длинной последовательностью бывает сложно найти фермент, не разрезающий ее. [c.243]

Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГРЧ синтезируют методами генетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках Е. соИ, ГРЧ содержит дополнительный остаток метионина на НгН-конце молекулы. Биосинтез ГРЧ из 191 аминокислотного остатка бьш осуществлен в 1979 г. Д. Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кДНК далее путем расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот, — с фен (—NH2) до лей (23), и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре 1ас-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 100 000 молекул гормона на клетку. Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной био- [c.138]

Получение гибридных плазмид, содержащих любые фрагменты ДНК, основывается на применении рест-jDUKraa — ферментов, узнающих короткие последовательности ДНК и разрезающих молекулы ДНК в соответствующих местах. Гибридные плазмиды клонируют — размножают — вместе с бактериями, в которые они введены. [c.268]

По-видимому, это был первый случай в истории, когда о начале великой технологической революции возвестил биржевой колокол. В 1980 г., когда фирма Genente h впервые предложила обществу свои акции, это была небольшая компания в Калифорнии, в течение четырех лет успешно работавшая над проблемой получения рекомбинантных ДНК. За два года до этого ученым компании удалось выделить фрагменты гена (последовательности ДНК), кодирующие человеческий инсулин, и перенести их в генетические элементы (клонирующие векторы), способные реплицироваться в клетках обычной кишечной палочки Es heri hia oli). Эти бактериальные клетки работали как биологические фабрики по производству человеческого инсулина, который после соответствующей очистки мог использоваться как лекарственный препарат для больных диабетом, дающих аллергическую реакцию на свиной инсулин. Еще десять лет назад такое развитие событий представ- [c.15]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Один из клонирующих векторов системы слияния, сконструированных для получения специфических антител, содержит 5 "-концевой сегмент гена ompF Е. соН, кодирующего один из наружных мембранных белков, и прилегающую к нему часть гена la Z (Р-галактозидазы) Е. соИ (рис. 6.7). Этот сегмент содержит информацию, необходимую для инициации транскрипции и трансляции химерного гена, а также для секреции химерного белка. Несмотря на то что укороченный ген la Z лищен кодонов для первых восьми аминокислот, кодируемый им белок сохраняет ферментативную активность. В такой [c.113]

При переработке растительного материала часто образуется большое количество лигноцеллюлозных отходов, которые раньше не находили применения. Сейсас лигноцеллюлоза служит сырьем для получения углеродсодержащих соединений, в первую очередь глюкозы, которые можно использовать в других процессах. Лигноцеллюлоза - это комплекс из лигнина, гемицеллюлозы и целлюлозы, не подверженный действию ферментов без предварительной обработки. Проводимые в последнее время исследования были направлены в основном на изучение механизма расщепления целлюлозы с образованием глюкозы. Клонированы и охарактеризованы гены эндоглюканаз, экзоглюканаз и р-глюкозидаз многих микроорганизмов, но пока не определен набор ферментов, осуществляющих масштабное эффективное расщепление целлюлозы in vitro. [c.303]

Для получения аденовирусного вектора провели котрансфекцию клеточной линии, синтезирующей продукты аденовирусного гена El, двумя участками генома аденовируса (рис. 21.7). Один из них может существовать в виде плазмиды в Е. соИ и содержит вместо El-области терапевтический ген, фланкируемый нуклеотидными последовательностями аденовируса, а второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5 -концевого участка, включающего Е1-область, и имеет перекрывающийся участок с несущей терапевтический ген плазмидой. Рекомбинация между двумя трансфицирующими фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного аденовирусного гена, в котором вместо El-области находится терапевтический ген. Продукты гена El, поставляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобождающихся из клетки в результате лизиса. Клонирующая емкость аденовирусного вектора [c.494]

Для его получения использовали набор химически синтезированных олигонуклеотидов, состоящих из 18-нуклеотидных фланкирующих областей (праймеров) и центрального 60-нук-леотидного участка, где в каждом из 60 положений может находиться любой из четырех нуклеотидов. Теоретически такой набор содержит примерно 1,3 10 (4 ) олигонуклеотидов с разной центральной последовательностью. Образец пропустили через колонку, содержащую связанные молекулы тромбина, присоединившиеся к тромбину олигонуклеотиды элюировали и повторно пропустили через колонку со связанным тромбином. Эту процедуру повторяли не менее трех раз. Конечный набор тромбино-вых аптамеров амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали, после чего определили физические и биологические свойства каждого из них. Те аптамеры, которые обладали высокими сродством, специфичностью и антитромбино-вой активностью, отбирали для более детального анализа. [c.508]

Линия гибридомных клеток не истинно нейрональная модельная система, однако она должна быть упомянута здесь, поскольку представляет собой полезный инструмент исследования в нейрохимии. Каждый В-лимфоцит обычно секретирует только один тип антител. Смесь большого числа моноспецифических антител образует нормальную гетерогенную антисыворотку. Для получения высокопродуктивных моноспецифических лимфоцитов, секретирующих антитела, Кёлер и Милштейн проводили слияние В-клеток иммунной мыши с опухолевыми клетками. В отличие от нормальных лимфоцитов, полученные гибридные клетки растут и размножаются практически бесконечно и продуцируют смесь антител против антигена, используемого для иммунизации. Даже если антиген является индивидуальным белком, продуцируемые антитела представляют собой смесь многих антител, каждое из которых направлено против одного специфичного антигенного участка исходной молекулы. Для получения моноспецифической сыворотки, т. е. раствора антител против одной антигенной области и происходящих из одного вида гибридомных клеток, эти клетки необходимо отобрать и клонировать . Теперь клон продуцирует моноклональные антитела , гомогенную популяцию антител против только одной детерминанты антигена. Эти моноклональные антитела можно пспользовать для разнообразных исследований, например для идентификации функциональных участков молекулы. Но что еще более важно, такой метод может использоваться для полу- [c.371]

После получения вектора, соединенного с кДНК, можно приступать к трансформации компетентных, т. е. способных к трансформации, клеток. При взаимодействии векторов, нагруженных кДНК, с компетентными клетками в некоторые из них проникает чужеродная ДНК, что ведет к образованию трансформированных клеток. Эти клетки отбирают и клонируют с целью получения копий целевого гена. Идентификация клеток, несущих целевой ген, часто определяет успех проведения генно-инженерных разработок и проводится в два этапа. [c.501]

Были клонированы гены ряда белков, необходимых в медицине. Нужный для лечения диабета инсулин в настоящее время получают из поджелудочной железы забитых на бойне животных. Хотя такой инсулин удовлетворяет сегодняшние потребности в этом препарате, тем не менее в связи с увеличением случаев заболевания сахарным диабетом, которому в США подвержено более 5% населения, в какой-то момент спрос может превысить предложение. Кроме того, инсулин забиваемых на бойнях животных не идентичен по своей аминокислотной последовательности инсулину человека, и потому для некоторых людей он неэффективен и даже непереносим. Недавно удалось заставить Е. соН синтезировать инсулин человека, введя в нее соответствующий ген. Полученный таким способом синтетический инсулин человека уже применяется при лечении диабета. Сходным образом благодаря рекомбинантным ДНК стало возможным использование в лечебной практике гипофизарного гормона роста (соматотропина), ранее недоступного для медицинских целей. Это важно потому, что гормон роста животных из-за различий в аминокислотной последовательности соматотропина человека и животньк неэффективен при лечении карликовости человека. [c.989]

Генетическая селекция in vivo может обеспечить способность организма к разложению специфического вещества. Однако подобные методики нуждаются в длительном периоде селекции (8—10 мес, как описано выше) и основываются на случайном наборе генетического материала для получения желаемой катаболической системы. Использование методов рекомбинантной ДНК дает экспериментатору возможность соединять вместе определенные катаболические последовательности и контролировать экспрессию специфических генов. Уровень экспрессии, определяемый in vivo, зависит от регуляторных механизмов, кодируемых плазмидными последовательностями, и мало что можно сделать, чтобы повлиять на выход отдельных ферментов. Однако можно получить повышенный уровень генного продукта, клонируя определенные гены в векторах по направлению транскрипции промоторных последовательностей. [c.334]

Вакцинация, рекомендуемая тем, кто посещает эндемичные холерные области и живет там. Вакцина содержит убитые нагреванием вибрионы. Она эффективна лишь в 40—60% случаев, а искусственный иммунитет сохраняется примерно 3—6 месяцев. Однако повторная вакцинация (бустер-доза) быстро вызывает иммунологический ответ и обеспечивает защиту при вспышке эпидемии. Ведутся работы по созданию вакцины методами генной инженерии. Для этого необходимо идентифицировать и клонировать гены, кодирующие синтез токсина. Еще один многообещающий подход — получение низковирулентного (ослабленного, или аттенуированного) штамма вибриона, у которого один или два гена токсичности отсутствуют. [c.206]

Если на первом этапе клонирования использовался метод дробовика , то бактерии, включившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клонируются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, называется библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мРНК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиночный ген (синтезированный или считанный с мРНК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде библиотек. [c.224]

Плазмиды-небольшие элементы бактерий, реплици-руюшиеся независимо от бактериальной хромосомы (гл. 31). Геном плазмид всегда представляет собой кольцевую двухцепочечную ДНК и имеет систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Сушествует два основных типа плазмид. В случае однокопийных плазмид на хромосому клетки-хозяина приходится 1 молекула плазмидной ДНК. Мультикопийные плазмиды присутствуют в клетке в большем количестве, обычно состав-ляюшем около 10-20 плазмидных геномов на клетку. Некоторые плазмиды находятся под ослабленным контролем репликации, в результате чего при прекрашении роста бактерий они накапливаются в очень больших количествах ( 1000 плазмидных геномов на клетку). Такие плазмиды часто используют для получения клонирующих векторов, поскольку они обеспечивают более высокий выход материала. [c.237]

Часто природные плазмиды обладают многими, но не всеми необходимыми свойствами клонирующего вектора. В целях создания лучших векторов из исходного природного материала было разработано несколько подходов. Эти подходы могут заключаться во внесении изменений в систему контроля репликации или в добавлении в плазмиду генов, определяющих устойчивость к специфическим антибиотикам. Один из стандартных клонирующих векторов, наиболее широко используемых в настоящее время, рВЮ22, был получен путем нескольких последовательных изменений ранее существующих клонирующих векторов. Это мультикопийная плазмида, несущая гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину и имеющая в удобных участках сайты рестрикции для нескольких рестриктаз. [c.237]

Часто для решения этой проблемы фрагмент вектора, не несущий необходимых для жизнедеятельности фага генов, заменяют на чужеродную ДНК вместо ее простого встраивания в качестве дополнительного материала. Такой подход дал блестящие результаты в случае фага X, где путем преобразования ДНК был получен более короткий геном (содержащий только жизненно важные гены), включающий только один сайт рестрикции для рестриктазы ЕсоК1. Сам по себе этот клонирующий вектор слишком короток для его упаковки в головке фага, кото- [c.237]

Клонирование всего генома (в противоположность клонированию специфических фрагментов) часто называют шотган -экспериментами (shotgun experiment-метод дробовика). Для их осуществления весь геном разделяют на фрагменты удобного размера. Затем фрагменты встраивают в клонирующий вектор с образованием популяции химерных векторов. Набор таких клонированных фрагментов называют библиотекой генома. Библиотека, однажды полученная с помощью фагового или плазмидного вектора (чаще-фагового вектора, поскольку в таком виде легче хранить необходимые большие количества химерных ДНК), может храниться неограниченно долгое время и при появлении нового зонда быстро может быть использована для поиска специфического фрагмента. [c.243]

Число случайно полученных фрагментов, которые должны быть клонированы для того, чтобы обеспечить высокую вероятность наличия каждой последовательности генома хотя бы в одной химерной плазмиде, уменьшается с ростом размеров фрагмента и увеличивается с ростом размеров генома и желаемой вероятности. Для 99%-ной вероятности необходимо 1500 клонов с фрагментами ДНК Е. соИ для дрожжей размер библиотеки возрастает до 4600 клонов, для D. melanogaster-до 48 ООО и до 800 ООО-для млекопитающих. Все эти библиотеки клонированных фрагментов, где достигается такая ве- [c.244]

Как же определить, имеем ли мы дело с множеством копий одного гена или с прерывистым геном Обычно для решения этой проблемы используют зонды, полученные из субклонов, содержащих последовательности, соответствующие только определенным областям мРНК. Такие последовательности получают путем разрезания клонированной кДНК на 5 - и З -области подходящей рестриктазой (т.е. такой, которая вносит разрыв в нужное место последовательности, соответствующей мРНК.) Затем такие специфичные по отношению к концам РНК зонды по отдельности повторно клонируют в других плазмидах. [c.251]

Смотреть страницы где упоминается термин Клонированная ДНК, получение: [c.231] [c.115] [c.115] [c.287] [c.141] [c.215] [c.73] [c.139] [c.247] [c.322] [c.392] [c.468] [c.372] [c.371] [c.987] [c.18] [c.335] [c.70] [c.194] [c.217] [c.237] [c.242] [c.18]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология