Оптимизация генной экспрессии

Приемы конструирования штаммов методами генной инженерии во многом зависят от целей промышленности. Наиболее ясная и лучше всего разработанная задача — это производство методами микробиологического синтеза белков человека, важных для медицины, или белков сельскохозяйственных животных для целей ветеринарии. С точки зрения генной инженерии эта задача сводится к введению чужеродного гена в удобный для промышленного производства микроорганизм и оптимизации его экспрессии, [c.97]

Соблюдение условий, необходимых для транскрипции и трансляции клонированных генов, как и в случае бактериальных систем экспрессии, еще не гарантирует высокий уровень синтеза кодируемого этим геном белкового продукта. Многие белки (и мРНК) нестабильны в клетках дрожжей. Так, проинсулин человека крайне нестабилен в дрожжевых системах экспрессии (это не относится к рекомбинантному интерферону а2). На эффективность экспрессии рекомбинантных генов в клетках дрожжей оказывает влияние множество до конца не изученных факторов, и оптимизация этого процесса при решении конкретных биотехнологических задач в каждом случае требует проведения специальных исследований. [c.173]

Никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонированных генов не существует. Больщинство таких генов имеют уникальные молекулярные свойства, и оптимальные системы экспрессии для каждого из них приходится подбирать всякий раз заново. Эффективность экспрессии любого чужеродного гена зависит также от его родства с организмом-хозяином. Несмотря на то что многие представители как про- так эукариотических организмов способны [c.105]

Преодолеть указанные затруднения можно лишь при экспрессии клонированных генов в гомологичной системе. Поэтому внимание исследователей наряду с оптимизацией генно-инженерной системы дрожжей привлекает разработка методов клонирования и экспрессии генов в клетках высших эукариот. [c.322]

Оптимизация генной экспрессии [c.208]

Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах [c.105]

Оптимизация экспрессии генов в других бактериальных системах [c.347]

Оптимизация экспрессии клонированных геное [c.265]

Одна из важнейших задач генетической инженерии — созда1ше условий для эффективной экспрессии клонируемых в бактериях генов. Разработка путей оптимизации такой экспрессии — шаг к получению высокопродуктивных бактериальных штаммов, направляющих синтез необходимых белков и других биологически активных соединений. Повышенная продукция белков, детерминируемых клонированными генами, достигается при выполнении ряда условий [c.139]

Возможен и другой подход к оптимизации экспрессии чужеродных генов в клетках В. subtilis. Изучаемый структурный ген соединяют с синтетическим сегментом ДНК, кодирующим участок связывания рибосом, специфичный для бацилл. Такую конструкцию затем можно помещать под контроль разнообразных промоторов. В частности, используя различные синтетические сегменты ДНК, содержащие SD-последо-вательности, Дж. Флок с соавторами (1984 г.) получили гибридные плазмиды, которые в клетках В. subtilis направляли синтез поли-пептидного гормона человека урогастрона в свободном виде. Данный прием является достаточно общим и может быть использован при клонировании в клетках бацилл любых генов. [c.267]

Оптимизация синтеза необходимого продукта -серьезная научная проблема. Если речь идет о белках, то для ее решения обычно используют клонированные гены, находящиеся под контролем сильных регулируемых промоторов. Вначале полагали, что для получения нужного количества продукта будет достаточно конститутивной экспрессии клонированного гена. Однако опыт показал, что при непрерывной транскрипции и трансляции клонированного гена истощаются все энергетические ресурсы клетки и ее рост замедляется. Чтобы приурочить экспрессию клонированного гена к определенной фазе роста, можно использовать механизм индукции. Для этого вначале выращивают клетки в оптимальных условиях до относительно высокой плотности, а затем индуцируют транскрипцию, либо изменяя температуру, либо добавляя в среду тот или иной химический индуктор в зависимости от природы промотора (например, изопропил-Р тиогалактопиранозид). [c.360]

Какого бы типа векторные плазмиды ни использовались, для эффективного инициациирования тракскрипции необходимо, чтобы в их составе присутствовал дрожжевой промотор. Чаще всего используют гликолитические промоторы. Поскольку ферменты гликолиза, несмотря на то что они кодируются уникальными генами, составляют от 1 до 5% суммарного клеточного белка, можно было предположить (и зто оказалось верно), что промоторы соответствующих генов относятся к разряду сильных промоторов. Другое необходимое условие успешной экспрессии — это эффективное терминирование транскрипции. Дрожжевые клетки обычно узнают терминаторные последовательности млекопитающих, однако с точки зрения оптимизации системы имеет смысл ввести в вектор дрожжевой терминатор (рис. 7.1). Промотор и терминатор разделены уникальным сайтом рестрикции, что позволяет реализовать стандартный путь создания рекомбинантной конструкции с интересующим структурным геном. [c.215]

Работа, проведенная Фроммом с соавторами [12], помогла определить условия, дающие максимальную экспрессию легко скринируемого продукта индикаторного гена (хлорамфениколацетилтрансферазы, AT) после электропорации протопластов векторной ДНК, несущей этот ген (анализ данного фермента описан в разд. 6.4.2). В этих экспериментах было показано, что эффективность электропорации, которая измеряется количеством ДНК, поглощенной протопластами, можно количественно связать с активностью AT. Поэтому оптимизация методики электропорации заключается в том, чтобы подвергать популяцию протопластов различным по напряжению, длительности и времени спада импульсам, а также использовать серии импульсов, а затем анализировать через соответствующее время активность AT. Результаты таких экспериментов менее прямые, чем кажется на первый взгляд, поскольку увеличение напряжения и длительности импульса приводит к пропорцио нальному увеличению гибели клеток. В результате величина ак тивности AT, выявленной в популяции протопластов, недо оценивает количество вектора, включенного каждой клеткой Поэтому эффективность электропорации зависит от того, изме ряют ли ее на всей исходной популяции или на тех клетках, которые остаются жизнеспособными после обработки. Фромм с соавторами [12] сообщил, что импульс длительностью 54 мс при 350 В обеспечивает максимальную активность AT и она достигает пика через 24—48 ч после электропорации. Однако [c.215]

Приведенные примеры четко демонстрируют роль двух основных факторов, оказывающих влияние на уровень экспрессии чужеродных клонированных генов, находящихся в составе экспрессирующих векторов в бактериальных клетках. Этими факторами являются, во-первых, оптимальная транскрипция клонированных генов и, во-вторых, эффективная трансляция транскрибированной мРНК. В обоих случаях наилучшие результаты могут быть получены при объединении в составе вектора структурной части клонированного чужеродного гена с генетическими элементами, регулирующими транскрипцию и трансляцию (промоторы, SD-последовательности и т.п.) бактериальных клеток-хозяев или их вирусов. Знание главных принципов, лежащих в основе регуляции транскрипции и трансляции, позволяет конструировать новые регуляторные последовательности (например, промотор Taq) путем объединения известных регуляторных элементов или использования искусственно синтезированных последовательностей нуклеотидов, представляющих собой усредненные канонические регуляторные последовательности, учитывающие особенности большого числа природных регуляторных элементов. Однако этими важными факторами не исчерпывается возможность оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в чужеродном генетическом окружении. [c.114]

Прежде всего, это необходимость правильного фолдинга исследуемого полипептида в составе гибридной молекулы, что особенно проблематично в том случае, когда белок имеет небактериальное происхождение. Кроме того, рекомбинантный белок, будучи экспонированным на поверхности фаговых частиц, должен обладать достаточной стабильностью. Эти и многие другие проблемы, связанные с недостаточной эффективностью экспрессии гибридных генов в системе фагового дисплея, должны решаться с использованием общих подходов к оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в бактериальных системах, рассмотренных в первой части книги. С помощью подходящих бактериальных штаммов и условий культивирования можно решать многие из этих проблем. Тем не менее, при отборе ферментов с требуемыми свойствами чаще всего приходится пользоваться оригинальными подходами, к счастью опирающимися в своей основе на общие принципы, которые будут кратко перечислены ниже. [c.345]

Нами было установлено, что эффективность экспрессии в дрожжах и соответственно выход желаемого продукта можно увеличить многократно за счет ряда факторов 1) повышения стабильности вектора при включении в его состав гетерологичного энхансера репликации 2) минимизации размера вектора для повышения числа его копий 3) модификации кассеты экспрессии (индуцибельный промотор, специфичный терминатор, два АТГ кодона начала транскрипции), 4) создания штамма реципиента с ускоренным ростом культуры путем гибридизации неродственных гаплоидных штаммов (Арман и др., 1985 Чеперегин и др., 1990). Использование этих факторов оптимизации позволило создать первые отечественные штаммы дрожжей -высокоэффективные продуценты белка гена поверхностного антигена вируса гепатита В (HbsAg) для получения вакцины (Грановский и др., 1986 Чеперегин и др., 1990). В совместной работе с Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского разработаны условия ферментации штаммов - продуцентов и технология очистки белка, что подтверждено пятью авторскими свидетельствами и патентом (Арман и др., 1989). Вакцина прошла контроль в ГИСК им. Тарасевича, клинические испытания и была передана в производство. [c.71]

Благодаря разработке и совершенствованию методов клонирования и идентификации генов, секвенирования последовательностей ДНК, химического синтеза олигонуклеотидов, направленного мутагенеза молекул ДНК in vitro и оптимизации экспрессии целевых генов в клетках Е. соИ появилась возможность создавать мутантные формы генов и нарабатывать в достаточных для анализа количествах соответствующие им измененные варианты изучаемых белков. В целом направление исследований по конструированию методами генетической инженерии белков с измененными по отношению к природному прототипу свойствами, химерных белков, обладающих свойствами двух или более отдельных белков, и т. п., т. е. создание неприродных вариантов бежов и изучение их свойств, получило название белковая инженерия . [c.187]

При создании промышленного штамма микроорганизма во многих случаях необходимо добиться не максимальной экспрессии гена, а ее оптимизации. Очень высокий синтез некоторых белков часто летален для клетки. Для промышленного производства важно получить максимальный выход продукта с единицы объема ферментера в единицу времени, а не максимилып п1 синтез белка в пересчете на клетку. Так, высокий синтез некоторых белков может резко снизить скорость роста и жизнеспособность клеток и в конечном счете привести к снижению выхода продукта в промышленной ферментации. Получение белков, токсичных для микроорганизмов, часто выгодно проводить с регулируемым промотором в две стадии. В первой стадии при молчащем промоторе осуществляется рост биомассы, а затем путем изменения условий культивирования включается промотор. В этих условиях все клетки в аппарате одновременно начинают синтезировать продукт и их дальнейшая судьба пас не волнует. Типичными примерами регулируемых промоторов могут бьггь промоторы фага А, (Р[. и Рк) при наличии 15-мутации в гене-репрессоре. В этом случае включение осуществляется новьппением температуры в ферментере. Другой пример —промотор кислой фосфатазы у дрожжей, который можно включить перенесением культуры на среду, дефицитную по неорганическому фосфату. [c.102]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология