Замораживание-травление

Рис. 5.25. Электронная микрофотография ядра, на которой видны ядерные поры. (Препарат получен методом замораживания—травления.) хЗО ООО. При приготовлении таких препаратов быстро замороженные клетки раскалывают металлическим лезвием. Скол проходит в плоскости, представляющей наименьшее сопротивление, часто через мембрану. После удаления льда вытравленная поверхность обнажается.

В последние годы предложены новые методы подготовки мембранного материала, которые исключают возможность структурных изменений. Среди них наиболее известен метод замораживания —травления, сущность которого состоит в том, что мембранный материал предварительно импрегнируют антифризом (изотонический водный раствор глицерина) и замораживают в вакууме. Затем под вакуумом делается срез (скол) материала и с обнаженной поверхности приготавливается реплика, которую и исследуют. Этот метод создает возможность изучения мембран в их естественном водном окружении. Пропитка антифризом и быстрое замораживание ткани предотвращают образование льда и связанных с ним нарушений. В настоящее время с помощью этого метода изучено строение мембран различного типа, однако данные, полученные различными исследователями, интерпретируются неоднозначно. [c.378]

Рис. 4-23. Электронная микроскопия по методу замораживания-травления Замороженный образец раскалывают ножом (А). Затем, сублимируя воду под вакуумом, уменьшают слой льда и обнажают таим образом поверхность клетки (Б) После этого готовят реплику все еще замороженной поверхности (как описано в подписях к рис. 4-21) и проводят исследование с помощью просвечивающего электронного микроскопа.

Другой важный метод электронной микроскопии - метод замораживания-травления - используется для изучения внешней поверхности клеток и мембран. В данном случае клетки замораживают при очень низкой температуре и замороженный блок раскалывают лезвием ножа. Содержание льда вокруг клеток (и в меньшей степени внутри клеток) понижают возгонкой воды в вакууме при повышении температуры (процесс называют вакуумной сушкой) (рис. 4-23). Участки клетки, подвергнутые такому травлению, затем оттеняют (как было показано ранее) для приготовления платиновой реплики. [c.188]

К числу важнейших методов получения реплик относится метод замораживания—скалывания и замораживания—травления. Свежую ткань (которую можно предварительно обработать глицерином, чтобы предотвратить образование больших кристаллов льда) быстро замораживают. Поскольку такие замороженные клетки нередко удается потом оживить, их можно рассматривать как живые. Замороженную ткань помещают в вакуумную камеру, где делают сколы или срезы охлажденным ножом. Иногда образец какое-то время выдерживают в вакууме прн —100 °С, чтобы дать испариться молекулам воды с поверхности. В результате такого травления под вакуумом выявляется в виде четкого рельефа тонкая структура клеточных органелл и мембран. После травления тем или иным методом снимается реплика, которую и исследуют под микроскопом (рис. 1-11). Последние работы свидетельствуют, что скол проходит большей частью по липидному слою клеточных мембран. [c.20]

Электронная микроскопия с применением техники замораживания— травления подтверждает тот факт, что структуры, выявляемые с помощью сверхтонких срезов, не возникают в результате химической обработки, применяемой для приготовления образца (рис. 25.3.4в иг). [c.113]

Следовательно, и метод замораживания— травления пока не доказывает существования субъединиц в мембранах и в большей степени согласуется с концепцией слоистой структуры мембраны. [c.378]

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ МЕМБРАН, ОБРАБОТАННЫХ МЕТОДОМ ЗАМОРАЖИВАНИЯ—ТРАВЛЕНИЯ [c.224]

Методы электронной микроскопии замораживание-скалывание и замораживание травление обеспечивают уникальную возможность наблюдать внутреннее строение клетки [10] [c.186]

Поскольку в этом случае в микроскопе под вакуумом наблюдают не образцы, а реплики, полученные после оттенения металлом, методы замораживание - скалывание и замораживание - травление можно использовать для изучения замороженных нефиксированных клеток и исключить риск проявления артефактов, вызванных фиксацией. [c.188]

Получение реплик существенно для анализа поверхностей методом замораживания — скалывания и замораживания— травления. Обычно реплики готовят (с применением платино-углеродного напыления) на сколотых образцах, содержащихся при—100 °С. Техника замораживания—скалывания играет важную роль при исследовании внутренней структуры клеточной мембраны, а также образцов, которые не фиксировались и не изменялись путем химических воздействий. Однако для ее применения необходимо специальное оборудование и соответствующий опыт в работе. Описание конкретных методов получения реплик выходит за рамки настоящего руководства [46—48]. [c.119]

Достаточно полный источник информации по замораживанию — травлению. [c.132]

Замораживание—травление, замораживание—скалывание [c.135]

Плазмалемма обращена одной своей стороной к клеточной стенке, а другой — к цитоплазме обе эти оводненные структуры контактируют, как принято считать, с гидрофильными, заряженными участками мембран. Поскольку белки содержат больше заряженных групп, чем липиды, в первых моделях мембран предполагалось, что плазмалемма состоит из двух наружных белковых слоев (две темные линии на рис. 2.3) и одного липидного слоя между ними. Такая модель мембранной структуры оставалась общепризнанной до начала 1970-х гг., когда были получены некоторые новые данные и стало ясно, что модель нуждается в пересмотре. Несовместимыми с этой моделью сэндвича оказались, например, данные электронной микроскопии, полученные методом замораживания — травления. Исследуемую ткань сначала замораживают в жидком азоте, а затем раскалывают тупым микротомным ножом, так что скол проходит в плоскости, параллельной поверхности мембраны (рис. 2.6). После этого образец выдерживают под вакуумом для возгонки льда (сублимации). Эта процедура и называется травлением. Затем образец напыляют углем или металлом, чтобы выявить детали строения обнажившейся поверхности. Полученная таким образом реплика (копия) поверхности препара- [c.29]

Для исследования структуры мембран, находящихся непосредственно в клетке, во фракции изолированных плазматических мембран, а также при исследовании липидных или липидно-белковых искусственных мембран широко используется метод замораживания — травления, предложенный в 1957 г. М. Л. Стиром. Сущность этого метода заключается в том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при этой же температуре переносят в вакуумную установку. Там замороженный объект скалывают охлажденным ножом. В вакууме происходит возгонка замороженной воды. Этот процесс называется травлением. [c.95]

Вопрос о возможной организации тилакоидных мембран в фотосинтезирующие единицы, или квантосомы, пока не решен [86, 87]. Как было показано методом замораживания — травления, диаметр квантосом 20 нм, а толщина - 10 нм. Однако некоторыми исследователями были выявлены лишь частицы кубической формы меньшего размера которые могли быть молекулами рибулозодифосфат-карбоксилазы (ребро куба - 12 нм гл. 7, разд. К, 3,ж) или молекулами фактора сопряжения с синтезом АТР (ребро куба 10 нм, разд, Д, 6). [c.46]

В —внутренняя поверхность мембраны Н — наружная поверхнос1ъ мембраны. Плоскость скола прошла частично через ядерную мембрану, благодаря чему ядерные поры видны на внутренней и наружной поверхностях мембраны, х24000 (препарат получен методом замораживания-травлении) [c.47]

Метод замораживания - травления не позволяет использовать криппротекторы, поскольку они не летучи и по мере возгонки воды остаются в образце. Чтобы добиться высокого качества изображения, необходимо препятствовать образованию больших кристаллов льда. Это возможно при ускоренном замораживании образца (при скорости замораживания выше 20° С в миллисекунду). Один из методов такого быстрого замораживания состоит в использовании специального устройства, быстро сближающего образец с медным блоком, охлажденным до — 269°С жидким гелием. Особенно впечатляющие результаты получают после глубокого травления быстро замороженных клеток. Этот метод позволяет выявлять структуры внутреннего содержимого клеток, демонстрируя их трехмерную организацию с исключительной четкостью (рис. 4-24). [c.188]

Рис. 11-36. Эпителиальная клетка кишечника, в которой видна терминальная сеть, лежащая под апикальной плазматической мембраной (электронная микрофотография, метод замораживания-травления). Пучки актиновых филаментов, образующих сердцевину микроворсинок, продолжаются в терминальную сеть, где они соединены главным образом снектрином. Под терминальной сетью находится слой промежуточных

Тень формируется в результате отложения под определенным углом электроноплотного материала на образце во время пребывания в вакуумном испарителе. Те области, которые расположены под углом к направлению напыления металла, остаются не покрытыми им и, будучи менее электроноплотными, пропускают электроны. В результате электроны как бы очерчивают эти области, которые на обработанном негативе видны в виде черных теней. Поскольку выглядит это, как позитивное изображение, обычно (хотя и не всегда) негативы обращают контактным способом и для воспроизведения позитивного изображения окончательные фотографические отпечатки получают с обращенных негативов. (Техника оттенения хорошо описана в гл. 5 [И] и в гл. 4 и 5 т. 2 многотомника [7].) Прямое отгенение испаряющимися металлами применяется по отношению к целым клеткам или их компонентам, бактериофагам или различным суспензиям этот метод используется также для анализа реплик, приготовленных из интактных препаратов или при замораживании—скалывании и замораживании—травлении (см. ниже). Помимо очерчивания поверхностных неровностей и периодически повторяющихся структур, техника оттенения может применяться для измерения высоты образца по вертикали посредством нахождения длины тени и геометрических расчетов, опирающихся на известный угол оттенения. Измерению [c.117]

Изнутри к клеточной стенке примыкает избирательно прони -цаемая плазматическая мембрана — плазмалемма, окружаю -щая всю цитоплазму н состоящая из белков и фосфолипидов Отдельные органеллы, например хлоропласты (центры фотосинтеза) и митохондрии (в которых протекает процесс дыхания)у. также окружены мембраной. Почти все части клетки пронизывает система взаимосвязанных секреторных м мбран — эндо-плазматический ретикулум. Стопки мембранных дисков — аппарат Гольджи или диктиосомы, — принимают, по-видимому участие в образовании вакуолей, также ограниченных мембра ной (тонопластом) и содержащих раствор различных органи ческих и неорганических веществ. Внутреннюю структуру мембран изучают методом замораживания — травления. Клетк№ прн этом замораживают и раскалывают тупым ножом. Раскалываются они вдоль естественных поверхностей, обычно вдоль мембран. После этого лед удаляют возгонкой под вакуумом и обнажившиеся участки напыляют углем или металлом. [c.78]

Рис. 10-32. Электронная микрофотография препарата реснички, полученного методом замораживания - травления. Динеиновые ручки (ДР) равномерно расположены вдоль всего периферийного дублета микротрубочек (ПД), связывая его с соседним дублетом. (С любезного разрешения John Heuser.)

Рис. 10-65. Прикрепление актиновых филаментов к плазматической мембране волосковой клетки из внутреннего уха курицы на участке, свободном от стереоцилий (электронная микрофотография, замораживание-травление). Плоскость скола пересекает мембрану клетки и подстилающую ее сеть актиновых филаментов. Тонкие белковые тяжи (указаны стрелками) соединяют концы актиновых филаментов с плазматической мембраной. (С любезного разрешения N. Hirokawa и L. G. Tilney.)

РИС. 4.15. Методика замораживания—травления. Образец помещают на подложку (А), замораживают ( ) и в вакууме делают скол охлажденным ножом (В). При травлении (Г) лед сублимируется, и обнажаются поверхностные структуры. [D. Branton, Pro .Nat. A ad.S i. USA, 55, 1048, (1966).] [c.225]

Полученные результаты представлены на рис. 4.18 видно распределение ферритина (чфные точки) на наружной поверхности мембраны. От двух до восьми точек образуют кластеры, заключенные на рисунке в кружки. Каждый кластер соответствует одному антигену Rhp(D), а каждая точка — одному козьему антителу, прореагировавшему с человеческим IgG, который связан с этим антигеном. Рис. 4.18 показывает, что поверхностный антиген RHq D) распределен по наружной поверхности мембраны случайным образом. Это согласуется с данными, полученными методом замораживания—травления как видно из рис. 4.17, белковые частицы распределены по внутренней поверхности скола мембраны A holeplasma laidlawii нерегулярно. [c.228]

Для исследования образцов, из которых растворитель полностью не удаляется, был разработан ряд оригинальных методов. Одним из них является метод замораживания—травления. Замороженный образец раскалывают ударом ножа и затем лиофилизу-ют. При этом растворитель сублимирует, нелетучие макромолекулы выступают из замороженного юдного слоя, и в результате на поверхности выявляется тонкая структура образца. Затем с помощью специального источника на исследуемую поверхность напыляют атомы углерода, благодаря чему создается тонкая углеродная пленка, являющаяся репликой поверхности. Углеродную реплику осторожно отделяют от поверхности и помещают на сетку электронного микроскопа. После оттенения тяжелыми атомами реплику исследуют обычным способом в микроскопе. Внешний вид образцов, приготовленных методом замораживания—травления или сходным методом, часто значительно отличается от вида образцов, приготовленных простым высушиванием на воздухе фиксированных образцов. Например, рибосомы 70S, приготовленные методом замораживания—травления, имеют размеры 170х 230 х 250 А и соответственно объем 5,1 10 A . Более распространенный метод простого высушивания обычно дает размеры 160х 180 х 200 A и соответственно меньший объем 3,0 10 A . Данная ситуация напоминает случай уменьшения объема при превращении сливы в чернослив, причем оценить такое уменьшение довольно трудно. [c.180]

Появление новых сканирующих электронных микроскопов с более высоким разрешением привело к тому, что трудный и требующий больших затрат времени метод одноступенчатых реплик, используемый для выявления тоцографии поверхности, стал считаться едва ли не устаревшим. Хотя с помощью этого метода по-прежнему можно получать контрастные и четкие микрофотографии при высоких увеличениях, его применяют все меньше из-за трудоемкости связанных с ним операций. Кроме того, существует опасность разрушения образца. Совершенно очевидно, что в тех случаях, когда основной целью является получение информации о топографии поверхности, более предпочтителен сканирующий электронный микроскоп. Заслуживает упоминания одно исключение по-видимому, замораживание-скалывание и замораживание-травление биологической ткани лучше проводить с помощью получения реплик. Тем, кто интересуется этим вопросом подробно, следует обратиться к специальным публикациям. [c.233]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология