Замораживание-скалывание

Рис. 7.12. Тилакоиды хлоропласта, полученные методом замораживания—скалывания. Видна поверхность скола мембран. Обратите внимание на частицы, покрывающие поверхность мембран - это фотосистемы. Частицы ФС1 меньше частиц ФСН.

Рис. 6-27. Схема, показывающая, как с помощью электронной микроскопии образцов приготовленных методом замораживания - скалывания можно получить изображения внутренней гидрофобной поверхности цитоплазматической (или протоплазматической) половины бислоя (называемой Р-поверхностью) и наружной половины бислоя (называемой Е-поверхностью). После показанного здесь процесса скалывания открытые поверхности сколов оттеняют платиной и углеродом, органические вещества удаляют, а полученную платиновую реплику

Рис. 25-8. А. Схематическое изображение надпочечника в разрезе. Мозговой слой секретирует адреналин и норадреналин, корковый-стероидные гормоны коры надпочечников. Б. Полученная методом замораживания - скалывания реплика хромаффиновых гранул в цитоплазме клеток мозгового слоя надпочечников крысы. В этих гранулах содержатся в больших количествах адреналин и АТР. Под влиянием поступившего нервного сигнала происходит выделение содержимого гранул путем экзоцитоза.

На рис. 3 и 4 показана внутренняя сторона мембраны эритроцита электронная микрофотография на рис. 4 получена с использованием метода замораживания-скалывания. При приготовлении препаратов этим методом клетки сначала замораживают, а затем замороженный блок раскалывают. Иногда линия раскола проходит в плоскости между двумя липидными слоями (рис. 3). С обеих образующихся при этом поверхностей делают отпечатки, которые затем исследуют в электронном микроскопе (рис. 4). Внутренняя часть каждого из липидных слоев имеет гладкую поверхность расположенные на ней скопления-это молекулы интегральных белков. Стрелкой показан внешний край скола. [c.344]

К числу важнейших методов получения реплик относится метод замораживания—скалывания и замораживания—травления. Свежую ткань (которую можно предварительно обработать глицерином, чтобы предотвратить образование больших кристаллов льда) быстро замораживают. Поскольку такие замороженные клетки нередко удается потом оживить, их можно рассматривать как живые. Замороженную ткань помещают в вакуумную камеру, где делают сколы или срезы охлажденным ножом. Иногда образец какое-то время выдерживают в вакууме прн —100 °С, чтобы дать испариться молекулам воды с поверхности. В результате такого травления под вакуумом выявляется в виде четкого рельефа тонкая структура клеточных органелл и мембран. После травления тем или иным методом снимается реплика, которую и исследуют под микроскопом (рис. 1-11). Последние работы свидетельствуют, что скол проходит большей частью по липидному слою клеточных мембран. [c.20]

РИС. 5-1. Б. Электронно-микроскопическая фотография мембран теней двух эритроцитов. полученная методом замораживания — скалывания. На верхней части рисунка видна часть мембраны, прилегающая к цитоплазме. Гладкая область — это липиды видны многочисленные частицы. В ннжней части представлена наружная часть мембраны, которая содержит меньшее количество частиц. Пространство между мембранами заполнено оставшимся льдом. Электронные микрофотографии биологических мембран приведены также на рис. 1-2 1-4 и в дополнении 1-Б (С любезного разрешения [c.340]

Ни теоретические соображения, ни экспериментальные наблюдения не подтверждают модель сандвича . Представляется термодинамически маловероятным, чтобы белок успешно конкурировал с водой за полярные головки липидных молекул и слой белка мог бы экранировать их от водного окружения. Имеются также многочисленные экспериментальные данные, противоречащие такой модели, из которых самое очевидное — это электронно-микроскопическая картина мембраны, полученная методом замораживание — скалывание (рис. 3.4). На микрофотографии видны частицы, возможно белки, на внутренней поверхности бислоя. Биохимические методы также подтверждают заключение, что белки частично или целиком встроены в мембрану. Позднее мы еще вернемся к этому вопросу. [c.68]

С помощью метода замораживания—скалывания удалось выяснить, как встроены в фосфолипидный бислой белки. Этот метод предполагает бы- [c.183]

Рис. 23-6. А. Электронная микрофотография хлоропласта из листа пшината. Б. Схематическое изображение его структуры. В. Электронная микрофотография внутренней поверхности тилакоидной мембраны (препарат получен методом замораживания-скалывания). Частицы пирамидальной формы представляют собой, как полагают, молекулы ферментов, участвующих в фотосинтезе.

Методы электронной микроскопии замораживание-скалывание и замораживание травление обеспечивают уникальную возможность наблюдать внутреннее строение клетки [10] [c.186]

В клеточной биологии особенно успешно используются два метода, основанные на получении механических реплик. Один из них - метод электронной микроскопии замораживание-скалывание - дает возможность изучать внутреннее строение клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота (-196°С) в присутствии криопротектора (антифриза) во избежание искажений за счет образования кристаллов льда. Замороженный блок затем раскалывают [c.186]

Первые сведения о том, что молекулы липидов в биологической мембране образуют бислой, были получены в ходе простых, но элегантных экспериментов, выполненных в 1925 год) Было показано, что липиды из мембран эритроцитов, экстрагированные ацетоном, всплывают на поверхность воды, образуя пленку. Площадь пленки уменьшали с помощью подвижного барьера до тех пор, пока не формировался сплошной мономолекулярный слой. При этом оказалось, что площадь мопослоя примерно в два раза больше первоначальной площади поверхности клеток. Поскольку единственной мембраной эритроцитов является плазматическая мембрана, экспериментаторы заключили, что молекулы липидов в ней должны быть организованы в виде непрерывного бислоя. Это заключение имело глубокое влияние на всю клеточную биологию. В настоящее время наличие липидного бислоя в клеточных мембранах доказано и более тонкими методами. Например, с помощью рентгеноструктурного анализа было продемонстрировано существование липидных бислоев в высокоорганизованных складках клеточных мембран, которые формируют изолирующую миелиповую оболочку, окружающую нервные клетки (см. разд. 19.2.4). О том, что все биологические мембраны содержат липидные бислой- убедительно свидетельствуют и данные электронно-микроскопических исследований при изучении образцов, приготовленных методом замораживания скалывания, оказалось, что все клеточные мембраны могут быть механически расщеплены как раз между двумя липидными монослоями (см. разд. 6.2.6). Самопроизвольное формирование бислоя является особым свойством молекул липидов, которое реализуется даже вне клетки. [c.350]

Поскольку в этом случае в микроскопе под вакуумом наблюдают не образцы, а реплики, полученные после оттенения металлом, методы замораживание - скалывание и замораживание - травление можно использовать для изучения замороженных нефиксированных клеток и исключить риск проявления артефактов, вызванных фиксацией. [c.188]

Белок полосы 3 можно зарегистрировать в виде внутримембранных частиц с помощью электронной микроскопии в сочетании с замораживанием - скалыванием. В этом случае клетки замораживают в жидком азоте и полученный кусочек льда раскалывают острым ножом. Плоскость скола обычно проходит через гидрофобную сердцевину мембранного бислоя, разделяя его на два монослоя. Затем на образовавшиеся поверхности напыляют платину и рассматривают платиновые реплики [c.368]

Получение реплик существенно для анализа поверхностей методом замораживания — скалывания и замораживания— травления. Обычно реплики готовят (с применением платино-углеродного напыления) на сколотых образцах, содержащихся при—100 °С. Техника замораживания—скалывания играет важную роль при исследовании внутренней структуры клеточной мембраны, а также образцов, которые не фиксировались и не изменялись путем химических воздействий. Однако для ее применения необходимо специальное оборудование и соответствующий опыт в работе. Описание конкретных методов получения реплик выходит за рамки настоящего руководства [46—48]. [c.119]

Рис. 4-22. Электронная микрофотография тилакоидной мембраны хлоропластов клетки растений, полученная по методу замораживания-скалывания. Тилакоидные мембраны, осуществляющие фотосинтез, уложены в виде множества слоев. Плоскость скола переходит с одного слоя на другой и проходит через середину каждого липидного бислоя. Внутримембранные белки, которые содержатся в значительном количестве внутри двойного слоя, обнажаются и после натенения выявляются в виде вну гримембранных частиц в )той платиновой реплике. Самой крупной частицей, выявляемой на мембране, является комплекс из множества белков, образующих фотосистему II. (С любезного разрещения Ь. Р. 81аеЬеИп.)

Замораживание—травление, замораживание—скалывание [c.135]

Другой важный компонент мембрат эритроцитов — это гликопротеид с мол. весом 100 ООО, который сравнительно прочно закреплен В нутри мембраны и имеет углеводные цепи, выступающие в окружающий раствор [29]. На электронно-микроскопических фотографиях поверхностей мембранного бислоя, полученных методом замораживания— скалывания (рис. 5-1,5), видно, что в мембране на площади [c.353]

Специализироваппые межклеточные соединения особенно многочислеппы и важны в эпителиях, но во многих местах контакта между клетками и между клетками и матриксом они встречаются во всех тканях. В большинстве своем они слишком малы для того, чтобы их можно было увидеть в световой микроскоп, одиако их можно выявить с помощью электронной микроскопии в обычных препаратах или же в препаратах, полученных методом замораживания-скалывания. В обоих случаях видно, что взаимодействующие плазматические мембраны (а нередко и подстилающие их участки цитоплазмы и межклеточное пространство) имеют в этих местах высокоспехщализированную структуру. Клеточные соединения могут быть разделены на три функциональные группы 1) запирающие соедипепия, которые так теспо сцепляют клетки в эпителиальном пласте, что делают невозможным прохождение даже небольших молекул с одной стороны пласта на другую 2) прикрепительные контакты, которые механически связывают клетки (и их цитоскелеты) с соседними клетками или внеклеточным матриксом, и 3) коммуникационные контакты, по которым передаются химические или электрические сигналы между взаимодействующими клетками. [c.474]

Рис. 14-4. Структура плотного соедипепия между эпителиальными клетками тонкой кишки. А, Схема. Б. Электронная микрофотография препарата, полученного методом замораживания-скалывания. В. Обычная электронная микрофотография. Обратите внимание, что клетки ориентированы апикальными концами вниз. На фото Б плоскость микрофотографии параллельна плоскости мембраны видно, что плотное соединение образовано сетью из герметизирующих цепочек, опоясывающей каждую клетку в пласте. Эти герметизирующие цепочки видны как гребни из внутримембранных частиц на внутренней (хщтоплазматической) поверхности скола (В) или как комплемептарпые им бороздки на наружной поверхности мембраны (Н). На обычном препарате (В) соедипепие выглядит как серия фокальных контактов между наружными липидными слоями двух смежных мембран каждый такой контакт соответствует герметизирующей цепочке в поперечном разрезе. [Б и 5 из N. В.

Рис. 14-5. Современная модель строения плотного соединения. Предполагается, что смежные плазматические мембраны скреплены непрерывными цепочками из особых трапсмембраппых белков, осуществляющих контакт через межклеточное пространство и образующих герметичное соединение. Чтобы показать эти белковые цепочки, впутреппий липидпый мопослой одной из мембран на этой схеме отогнут. На препаратах, приготовленных методом замораживания -скалывания, белки плотного соединения остаются не на наружном монослое мембраны, как

Молекулярная структура плотного соединения еще не ясна, но электронная микроскопия с примепепием метода замораживания -скалывания показывает, что оно состоит из сети анастомозирующих волокон, которая оплетает апикальный конец каждой клетки по всей его окружности (рис. 14-4. А и В). На обычных электронных микрофотографиях они видны как серии локальных соединений между наружными поверхностями двух смежных плазматических мембран (рис. 14-4, В). Хотя все плотные соединения непроницаемы для макромолекул, их пропицаемость для малых молекул сильно различается у разных эпителиев. Например, в эпителии, выстилающем тонкий кишечник, плотные соединения в 10000 раз более проницаемы для ионов, чем в энителии мочевого пузыря Способность соедипепия препятствовать переходу ионов через межклеточные пространства увеличивается в логарифмической зависимости от числа волокон в сети, как если бы каждое волокно действовало как независимый барьер. Как полагают, волокна состоят из длинных рядов специфических трапсмембраппых белков каждой из двух контактирующих мембран, которые (белки) непосредственно соединяются друг с другом, замыкая межклеточное пространство (рис. 14-5). [c.477]

Рис. 14-68. Обобщенная схема адгезионных механизмов, используемых типичными эпрггелиальиыми клетками для прикрепления друг к другу и к внеклеточному матрикс> (базальной мембране). Слева представлены механизмы с участием специализированных областей, видимых при электронной микроскопии обычных препаратов и (или) препаратов, полученных методом замораживания-скалывания. Справа иные механизмы. В некоторых случаях в соелинении клеток между собой или с матриксом при помоши тех и других механизмов участвуют одни и те же гликопротеины клеточной поверхности. Как указывалось в тексте, все специализированные адгезионные механизмы, за исключением щелевых контактов, являются Са -зависимыми из остальных адгезионных механизмов лишь некоторые зависимы от

Рис. 20-45. Электронная микрофотография плазматической мембраны развивающегося сосудистого элемента ксилемы в корне перечника (препарат получен методом замораживания-скалывания). Гексагональные группировки белков в мембране ( розетки ) сконцентрированы в местах, где клеточная стенка утолщается (А) и встречаются реже в местах между утолщениями (Б). Предполагают, что розетки представляют собой комплексы целлюлозосинтазы. Каждый из этих комплексов, по-видимому, синтезирует от 60 до 70 цепей целлюлозы, входящих в состав каждой микрофибриллы. (С любезного разрешения .

Тень формируется в результате отложения под определенным углом электроноплотного материала на образце во время пребывания в вакуумном испарителе. Те области, которые расположены под углом к направлению напыления металла, остаются не покрытыми им и, будучи менее электроноплотными, пропускают электроны. В результате электроны как бы очерчивают эти области, которые на обработанном негативе видны в виде черных теней. Поскольку выглядит это, как позитивное изображение, обычно (хотя и не всегда) негативы обращают контактным способом и для воспроизведения позитивного изображения окончательные фотографические отпечатки получают с обращенных негативов. (Техника оттенения хорошо описана в гл. 5 [И] и в гл. 4 и 5 т. 2 многотомника [7].) Прямое отгенение испаряющимися металлами применяется по отношению к целым клеткам или их компонентам, бактериофагам или различным суспензиям этот метод используется также для анализа реплик, приготовленных из интактных препаратов или при замораживании—скалывании и замораживании—травлении (см. ниже). Помимо очерчивания поверхностных неровностей и периодически повторяющихся структур, техника оттенения может применяться для измерения высоты образца по вертикали посредством нахождения длины тени и геометрических расчетов, опирающихся на известный угол оттенения. Измерению [c.117]

Получаемые препараты обычно неоднородны по размерам везикул, а препарат Кабаяси и др. 22] содержал как нормальные, так и вывернутые везикулы, что видно на электронных микрофотографиях при использовании метода замораживания — скалывания. Из Е. соН [c.465]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология