Рибонуклеаза титрование

Рис. 3.23. Данные титрования боковых карбоксильных групп рибонуклеазы. Ионная сила сверху вниз 0,15 0,03 и 0,01 [512].

На фиг. 18 изображены кривые титрования рибонуклеазы — белка с небольшими, почти сферическими молекулами известного аминокислотного состава. В табл. 14 число групп рибонуклеазы, титруемых в различных [c.71]

Рис. 166. Данные по титрованию рибонуклеазы при 25 °С и ионной силе а—0,01 (О—0,03 о—0,15.

Рис, 168. Данные по титрованию трех нормальных фенольных групп рибонуклеазы , представленные в соответствии с уравнением (30-2) [c.631]

Пример необратимого изменения конформации, отображающегося на кривой титрования, уже был приведен для случая рибонуклеазы (см. рис. 32). Более наглядным примером может служить гемоглобин (рис. 172). Обратимая часть кривой титрования соответствует в данном случае относительно небольшому количеству групп, которые в обычных условиях титровались бы в кислой области. Гораздо большее количество титруется в необратимой области, зависящей от времени, при рН=3,5. То, что при этом pH происходит изменение конформации, подтверждается также спектрами поглощения. Природа такого изменения еще не выяснена. [c.640]

Предсказываемое влияние ионной силы на кривые титрования мало отличается от влияния, описываемого приближенной теорией. Об этом также можно судить по данным для рибонуклеазы, приведенным в табл. 39. Так, для значений ионной силы от 0,03 до 0,15 приближенная теория дает величину для Аш, равную 0,034, Как для фенольной, так и для карбоксильной групп наблюдается Аш=0,032, хотя абсолютные значения w сильно отличаются от вычисленных. [c.645]

Таким образом, разность определяется наклоном кривой титрования, подобно кривой, представленной на рис. 165. Например, для рибонуклеазы в изоэлектрической точке (2=0) можно таким путем найти [c.646]

Рис. 11. Кривые титрования трех обратимо титруемых фенольных групп рибонуклеазы нри 25° С [4] при различных ионных силах.

Рис. 14.10. Кривые титрования сигналов протонов при С-2 и С-4 гистидиновых остатков рибонуклеазы, соответствующие спект [39

Если конформационное изменение, сопровождающее процесс ионизации, обратимо, то такой же эффект наблюдается и при проведении обратного титрования. Часто, однако, возвращение к нативной конформации происходит очень медленно или даже оказывается невозможным. В таких случаях при обратном титровании остатки тирозина титруются нормально, так как отсутствует связь между процессом ионизации и конформационными изменениями. Более детальные экспериментальные данные приведены в гл. 7, где описано титрование остатков тирозина, входящих в состав рибонуклеазы, причем в данном случае специфическая ионизация этих остатков может наблюдаться оптическими методами. [c.51]

О возможности миграции ацильной группы в разбавленных водных растворах кислот высказывались различные предположения. Тенфорд [308] изучал кривые титрования нескольких подробно охарактеризованных белков (инсулин, рибонуклеаза, лизоцим, р-лактоглобулин, овальбумин и альбумин сыворотки крови человека). Он установил, что по крайней мере для указанных белков отсутствуют данные, свидетельствующие об увеличении количества аминогрупп при pH 2 — самом низком значении, достигнутом в ходе титрования. Приведенные выше данные показывают, что перегруппировка легче происходит в концентрированных водных растворах кислот. [c.222]

В процессе титрования белка от предельно кислой до предельно основной формы должно существовать такое значение pH, при котором суммарный заряд белка равен нулю. Это значение pH носит название изоэлектрическая точка (р[). При значении pH, равном изоэлектрической точке, белок максимально инертен, не перемещается в электрическом поле и имеет наиболее тонкую гидратную оболочку. Большинство белков имеют изоэлектрическую точку при нейтральных или близких к ним значениях pH, однако есть ряд исключений, например, для фермента желудочного сока пепсина р/ = 1,4, а для фермента рибонуклеазы — 10,5. Если в белковом растворе нет никаких ионов, кроме ионизированных аминокислотных остатков, то такие растворы называются изоионньши. [c.52]

Четыре остатка Гис рибонуклеазы были оттитрованы и отнесены по отдельности. Мы видели, что два из них (Гис-12 и Гис-119) входят в активный центр. Брэдбери и Шерага [6] первые показали (на 60 МГц), что протоны при С-2 гистидиновых остатков этого белка дают раздельные сигналы и можно провести титрование имидазольных колец так, как это описано в разд. 13.2 для свободного гистидина и в разд. 14.2.3 для единственного остатка гистидина в лизоциме. Жардетский и сотр. расширили эти наблюдения [21, 39—42]. Ароматическая область спектра (100 МГц) раствора рибонуклеазы в ОгО с дейтероацетатным буфером при четырех значениях pH, соответствующих величинам р/< гистидиновых имидазольных колец, приведена на рис. 14.9. Протоны при С-2 дают четыре раздельных пика слева от основного спектра при pH=4,95 [c.365]

Возможность получения количественных данных по связыванию для взаимодействия белков с иммобилизованным пептидом впервые исследована Гавронским и Уолдом [8]. Определена константа диссоциации, равная (2,5 1,0) 10 моль/л, путем прямого титрования 5-белка рибонуклеазы, связанного с 5-пептидом, иммобилизованным на агарозе. Хорошие кривые титрования получены при концентрации 8-белка 10 —моль/л. Когда концентрация связанного белка равна концентрации белок-пептидного комплекса, взаимодействие может быть описано соотношением [c.58]

Рис. 167. Данные по титрованию боковых карбоксильных групп рибонуклеазы , представленные в соответствии с уравнением (30-2) /—ионнная сила /=0Л5 2—/=0,03 3—1= -0,01.

Наконец, представляет интерес сделать еще одно замечание. По уравнению (30-6) можно определить средний общий заряд 2 первоначально изоионного белкового препарата как указывалось выше, это значение обычно очень мало. С другой стороны, по кривой титрования мы можем найти максимальное число ионов Н , которое может присоединиться к изоионной белковой макромолекуле. Сумма этих двух величин представляет собой наибольший положительный заряд, вызванный наличием ионов Н" , который может приобрести макромолекула белка. Это число равно общему количеству катионных участков (ЫНз и т. д.) в макромолекуле. Поэтому его можно определить по кривой титрования даже несмотря на то, что некоторые из катионных участков (гуанидильные группы) не титруются в экспериментально доступной области pH. Таким путем (по разности) было найдено число гуанидильных групп указанное для рибонуклеазы в табл. 38. [c.637]

Использование уравнения Линдерштрема-Ланга [22] позволяет более детально обработать кривые титрования и получить некотор то добавочную информацию. На рис. И приведены полученные спектрофотометрически кривые титрования трех обратимо титруемых фенольных групп рибонуклеазы при трех ионных силах. По оси ординат отложена величина, стоящая в левой части уравнения (22) и равная рК+ДрК (а). Видно, что в соответствии с теоретическими результатами электростатическое взаимодействие обусловливает линейную зависимость поправочного члена к рК от степени ионизации а. Рассчитанная по уравнению (22) величина т оказывается равной 0,11, 0,09 и 0,06 при ионных силах 0,01, 0,03 и 0,15, что приближенно совпадает со значением, вычисленным по формуле (23), если принять радиус белковой глобулы 6=17 А, как должно быть для компактной структуры молекулы данного молекулярного веса. Это показывает, что в случае рибонуклеазы отсутствуют какие-либо особенности в титровании трех фенольных групп. Напомним, что, как уже отмечалось, три другие фенольные группы в молекуле рибонуклеазы не титруются вплоть до значений pH, приводящих к денатурации. [c.37]

Часть промежуточных продуктов, образующихся при действии рибонуклеазы на рибонуклеиновые кислоты, составляют пиримидиновые нуклеозид-2, 3 -циклофосфаты, которые при дальнейшей обработке рибонуклеазой дают исключительно З -фосфаты [68, 69]. При гидролизе рибонуклеиновой кислоты под действием карбоната бария [68] или лучше трет-бугклата калия [70] были выделены пуриновые и пиримидиновые нуклеозид-2, 3 -циклофосфаты. Они образуются также при нагревании раствора нуклеиновой кислоты в формамиде с аммиаком [7П- На основании данных титрования этих веществ, их поведения при хроматографировании на бумаге и электрофорезе, кислотного и щелочного гидролиза их до 2 - и З -фосфатов, а также из сравнения их с синтетическими образцами этим соединениям было приписано строение 2, 3 -циклофосфатов [52, 53]. [c.133]

Полученный продукт промывали три раза растворителем и затем дважды — охлажденным эфиром. При титровании л-хлормер-курибензоатом найдено 8 SH-rpynn на 1 моль белка. Две дисульфид-ные связи, очевидно, расщепляются легко, но для расщепления двух других связей необходимо проводить реакцию в концентрированном растворе мочевины. Авторы описываемой работы наблюдали восстановление на 12—19% удельный активности нативной рибонуклеазы при пропускании воздуха в течение 68 час через раствор полностью восстановленного белка в 0,01 М фосфатном буфере при pH 7—8. Освобождаемые SH-группы легко блокируются путем обработки иодуксусной кислотой (700 молб) в течение 2 тс при pH 8,5. pH поддерживается на постоянном уровне добавлением 5%-ного раствора триметиламина при помощи прибора для автоматического титрования. [c.104]

ЧТО, в то время как М,0-ацильная миграция часто протекает медленно и редко доходит до конца, обратная реакция протекает быстро и практически полностью. Некоторые наблюдения Танфорда [62] ставят под сомнение возможность частичной ацильной миграции в водных растворах белков при низких значениях pH. При титровании до pH 2 рибонуклеазы, лизоцима, р-лактоглобулина, яичного альбумина и сывороточного альбумина человека не было отмечено сколько-нибудь существенных признаков ацильной миграции. [c.130]

Четыре остатка Гис рибонуклеазы были оттитрованы и отнесены по отдельности. Мы видели, что два из них (Гис-12 и Гис-119) входят в активный центр. Брэдбери и Шерага [6] первые показали (на 60 МГц), что протоны при С-2 гистидиновых остатков этого белка дают раздельные сигналы и можно провести титрование имидазольных колец так, как это описано в разд. 13.2 для свободного гистидина и в разд. 14.2.3 для единственного остатка гистидина в лизоциме. Жардетский и сотр. расширили эти наблюдения [21, 39—42]. Ароматическая область спектра (100 МГц) раствора рибонуклеазы в ОгО с дейтероацетатным буфером при четырех значениях pH, соответствующих величинам р/( гистидиновых имидазольных колец, приведена на рис. 14.9. Протоны при С-2 дают четыре раздельных пика слева от основного спектра при pH=4,95 (а), которые смещаются в сильное поле при повышении pH и сливаются при рН = 8,12 (б) вблизи 810 Гц. Один резонансный сигнал протона при С-4, помеченный цифрой 5, проявляется в сильном поле. Сигналы других С-4-протонов закрыты широким резонансным сигналом от ароматических протонов Фен и Тир с центром при 720 Гц. Зависимости химических сдвигов этих пяти протонов от pH представлены на рис. 14.10. Заметим, что шкала химических сдвигов на этом рисунке идет в противоположном направлении по сравнению с рис. 13.5. Значения р/С для каждого из гистидиновых остатков приведены на рисунке. Очевидно, что протон [c.365]

Золотистый стафилококк Staphylo o us aureus) вырабатывает внеклеточный фермент, одинаковый по молекулярной массе с рибо-нуклеазой (около 16500), но имеюш,ий более широкую специфичность. Он способен расщеплять как РНК, так и ДНК. Последовательность аминокислот известна для препарата, выделенного из штамма V8. Мидоус и сотр. [21] описали спектры ЯМР на частоте 100 МГц для препарата из другого штамма, который, подобно рибонуклеазе, содержит 4 остатка Гис, в то время как в ферменте из штамма V8 их только три. В спектре наблюдались отдельные пики от протонов при С-2 гистидиновых остатков. Титрование дало те же результаты, что и для рибонуклеазы. Отличие от последней наблюдается лишь для одного из этих сигналов, который избирательно смещается в область слабого поля под влиянием ионов Са +, если имидазольное кольцо находится в незаряженном состоянии. Известно, что ионы Са + необходимы для проявления ферментативной активности. [c.385]

Исследование методом ЯМР, выполненное Жардетским и сотр., является одним из наиболее информативных при изучении роли остатков гистидина в функционировании рибонуклеазы. С помощью ЯМР-спектроскопии (100 МГц) регистрируют протоны четырех остатков гистидина фермента (см. гл. 9 о ЯМР-спектроскопии). Каждый протон, связанный с С2-атомом имидазольной группы, характеризуется собственным химическим сдвигом, величина которого зависит от pH. Снимая зависимость химического сдвига от pH, можно построить кривые титрования (см. рис. 16.13). Кривые для протонов, связанных с С2-атомом остатков гистидина, пронумерованы на рис. 16.13 от 1 до 4. Кроме того, в спектре ЯМР присутствует еще один пик, приписываемый протону, связанному с С4-ато- [c.76]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология