Деградация по Эдману

Е. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ В ПЕПТИДАХ ДЕГРАДАЦИЕЙ ПО ЭДМАНУ И КОЛИЧЕСТВЕННЫМ АМИНОКИСЛОТНЫМ АНАЛИЗОМ [c.285]

Важнейший химический метод ступенчатой деградации пептидов с N-конца — фенилтиогидантоиновый метод (деградация по Эдману) [100]. [c.369]

Деградация по Эдману. Методика [c.372]

B заключение отметим, что несмотря на чрезвычайную перспективность масс-спектрометрии [30], метод деградации по Эдману применяется гораздо шире, главным образом благодаря большой информации, которую можно получить с его помощью. Однако масс-спектрометрия может создать здесь серьезную конкуренцию, если в будущем будет сведена на нет утомительная процедура выделения чистых пептидов. [c.279]

Рис, 2.28. Деградация по Эдману. От пептидной цепи отщепляют меченый Ы-концевой остаток аминокислоты (ФТГ-аланин на первой ступени деградации). Остаток пептидной цепи при этом не гидролизуется. На вто [c.31]

Каждый из выделенных пептидов затем изучают в отдельности. Для исследования аминокислотной последовательности наиболее удобны небольшие пептиды, содержащие от четырех до шести аминокислотных остатков. Для них легко установить N- и С-концевые аминокислоты, а также, применив деградацию по Эдману или гидролиз карбоксипептидазой А, определить всю последовательность. Крупные фрагменты после определения концевых остатков и аминокислотного состава обычно расщепляют дополнительным гидролизом на более мелкие части. [c.84]

Фенилтиогидантоины После деградации по Эдману [66] [c.314]

Для проведения последовательной деградации по Эдману часто используют автоматический прибор. При благоприятной ситуации с его помощью может быть пройдено от 40 до 50 шагов . После каждого шага отщепленный фенилтиогидантоин должен быть идентифицирован с использованием тонкослойной или газожидкостной хроматографии или подвергнут кислотному гидролизу с последующей идентификацией регенерированной аминокислоты. [c.175]

Оказывается, что различие состоит в одном остатке аланина. Следовательно, в исходном пептиде аланин занимает N-концевое положение. Деградацию по Эдману можно вновь повторить на укороченном пептиде. Исходя из аминокислотного состава после второй ступени деградации [c.30]

Альтернативным путем для установления последовательности коротких пептидов является деградация по Эдману на твердой фазе. По аналогии со способом Меррифилда деградируемый пептид связывается ковалентно с полимерным носителем и ступенчато расщепляется с К-конца. Принципиальная применимость этого метода доказана во многих лабораториях. В качестве носителя чаще всего используют устойчивый к трифторуксусной кислоте аминоалкилполистирол. Присоединение секвенируемого пептида более предпочтительно через амидную связь. [c.371]

Помимо непостоянных выходов, остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот также дают производные при последовательной деградации по Эдману. [c.269]

Очевидным продолжением выщеописанной техники является комбинация газо-жидкостной хроматографии и масс-спектромет-рии для того, чтобы разделять и идентифицировать короткие пептиды, получаемые после гидролиза протеиназами. Например, дипептиды, получаемые гидролизом с помощью дипептидиламино-пептидазы (см. разд. 23.3.4), можно модифицировать, разделить с помощью ГЖХ и идентифицировать масс-спектрометрически. Аналогично можно обработать альтернативный набор дипептидов, получаемых после предварительной деградации по Эдману (один цикл). [c.278]

Деградацию по Эдману можно комбинировать с дансильным методом. При этом после отщепления концевого остатка определяют N-конец оставшегося пептида и воспроизводят последовательность, основываясь на данных.N-концевого анализа. [c.283]

Пожалуй, следует упомянуть и о ГХ-анализе фенилтиогидан-тоинов (/) аминокислот [66]. К этим соединениям, образующимся, как известно, при деградации по Эдману [22], относится все то, что говорилось о метиловых эфирах ДНФ-аминокислот их разделение с помощью ГХ представляет интерес только р связи с деградацией пептидов. [c.322]

Этот подход не всегда приводит к желаемому результату из-за различных осложнений многообразие модифицированных сайтов, обусловленное подвижностью первоначального комплекса белка с реагентом, приводящей к неоднозначной фиксации реагента на белке-мишени нестабильность продукта модис)5икации на стадии разделения или деградации по Эдману и др. [c.332]

Октадекапептид, выделенный Франеком и сотр. [108] из триптического гидролизата Л-цепи свиного иммуноглобулина, был подвергнут [92] масс-спектрометрированию после ацетилирования N-конца с последующим перметилированием. Интерпретацией основных пиков в масс-спектре можно было определить последовательность десяти аминокислотных остатков с N-конца. Полученные результаты суммированы в табл. 2 и находятся в согласии с результатами, полученными независимо последовательной деградацией по Эдману. Масс-спектр также указал, что пептид содержит приблизительно эквимолекулярную смесь аланина и треонина во втором положении с N-конца. [c.226]

Оставшийся пептид можно еще раз обработать фенилизотиоцианатом, отщепить и идентифицировать вторую аминокислоту, затем третью и т. д. Поэтому метод иногда называют ступенчатая деградация по Эдману . [c.74]

После установления природы и числа аминокислот, входящих в состав молекулы белка, и определения С- и N-кoицeвыx аминокислот необходимо установить последовательность расположения аминокислот по длине цепи. В настоящее время непосредственное определение длинных последовательностей аминокислот еще лежит за пределами возможностей методов, которые имеются на вооружении химии белка. Поэтому общий подход к решению этой задачи заключается в том, что белковую цепь предварительно разрушают на ряд фрагментов, каждый из которых затем исследуют различными методами деградацией по Эдману, действием карбокси- или аминопептидаз и др. [c.79]

Разработана методика, где метод изотошюго разбавления используется в сочетании с деградацией по Эдману [15], Со-1 ласно одному из вариантов этого метода, проводят одну сталию деградации но Эдману, в ходе которой блокируются е-аминогруппы остатков лизина, а затем конденсируют второй Ы-кои-невой остаток с реагентом, содержащим радиоактивную метку [94]. В этом случае нет необходимости экстрагировать производное Ы-концевой аминокислоты. Для количественного определения белка в образце используют аминокислотный анализ, а в аликвотных пробах гидролизата определяют радиоактивность. Для определения удельной радиоактивности [ С]ФИТЦ образец очищенного пептида модифицируют аналогичным образом. [c.35]

Дисульфидные связи, соединяющие две или более полипептидные цепи, обычно доступны действию растворителей или реагентов даже в отсутствие денатурирующих агентов, тогда как внутрицепочечные 5—5-связи чаще всего бывают маскированы и недоступны. Это обстоятельство позволяет проводить избирательное восстановление экспонированных 5—5-связей. Полное восстановление дисульфидов рекомендуют проводить в слабокислой среде в присутствии мочевины или гунидингид-рохлорида. Ни один из денатурирующих агентов не свободен от недостатков. Например, примеси мочевины в образце генерируют цианат-ионы па стадии конденсации при деградации по Эдману, что может препятствовать секвенированию. Опыт применения гуанидин-НС1 не столь поучителен, однако при использовании хорошо очищенного препарата проблем при секвенировании не наблюдалось. [c.65]

Аналогичные результаты были получены при реакции белка с сульфитом натрия в 8 М мочевине в присутствии кислорода воздуха и следов цистеина [31]. Восстановление цистина дитиотреитом и последующая обработка тетратионатом натрия приводит к образованию S-сульфоцистеина с количественным выходом [85]. S-сульфоцистеин устойчив при нейтральном pH и в условиях деградации по Эдману, однако при восстановлении образует цистеин. При гидролизе белков 6М НС1 S-суль-фоиистеин превращается в цистин [37]. Серьезную проблему представляет контроль за полнотой реакции при использовании [ S]сульфита контроль ведут по включению метки [31]. [c.66]

НИН [155] или кииуренин [11], более стабильные в условиях деградации по Эдману. Метод, предложенный в работе [155], более специфичен (разд. 2.5.3), При превращении триптофана побочной реакцией является образование метионин-5-оксида, который может быть избирательно восстановлен в метионцн [c.74]

Выбор ферментов для последующего расщепления определяется различными факторами и преследует цель получить небольшие пептиды, содержащие одну дисульфидную связь. Наиболее часто применяют обработку трипсином, химотрипси-ном, стафилококковой протеазой или термолизином в отдельности или в различных сочетаниях. Иногда с успехом используют ферменты с более узкой специфичностью, иапример плаз-мин, эластазу [5, И]. Для анализа пептидов, содержащих две дисульфидные связи, разделенные несколькими остатками аминокислот применяют деградацию по Эдману [20]. [c.170]

После расщепления бромоцианом и триптического гидролиза были выделены три коротких пептида, связанные дисульфидными мостиками (вероятное положение дисульфидных связей указано штриховыми линиями). Поскольку при анализе руководствовались известной структурой, пептиды были подвергнуты одностадийной деградации по Эдману в секвенсере, обессолены и фракционированы. При этом были получены два фрагмента [c.175]

Водную фазу высушивают и растворяют в 1%-ном триэтиламине. Часть раствора берут на дансилирование, остаток высушивают и проводят слсдующт1й цикл деградации по Эдману, Если необходимо прервать процесс, то делают это всегда после стадии расщепления. [c.373]

В общих чертах стратегия Сенгера сохранила свое значение и до наших дней, однако за истекшие десятилетия были разработаны два новых подхода, которые произвели революцию в определении первичной структуры полипептидов (белков). Первый подход основан на разработанной Эдманом в 1967 г. автоматической процедуре последовательного отщепления и идентификации N-кoнцeвыx аминокислотных остатков в виде их фенилтиогидантоиновых производных. Второй подход связан с методом, разработанным Сенгером и, независимо, Максамом и Гилбертом, позволяющим проводить быстрое и однозначное секвенирование гена, кодирующего рассматриваемый белок. Оптимальная стратегия состоит в одновременном использовании обоих подходов. Автоматическая деградация по Эдману, намного более быстрая по сравнению с первоначальным ручным методом Сенгера, тем не менее сильно уступает по скорости методам секвенирования ДНК и сопряжена с рядом трудностей. С другой стороны, секвенирование ДНК не всегда дает однозначную первичную структуру исследуемого белка. Главным [c.38]

Анализ структуры белков удалось значительно ускорить путем создания секвенато-ра-специального прибора для автоматического определения последовательности ами нокислот При таком определении белок в виде тонкой пленки помещают во вращающийся цилиндрический сосуд, где он подвергается деградации по Эдману. Реак- [c.32]

Смотреть страницы где упоминается термин Деградация по Эдману: [c.94] [c.404] [c.404] [c.404] [c.413] [c.370] [c.372] [c.256] [c.271] [c.57] [c.58] [c.332] [c.35] [c.36] [c.372] [c.178] [c.183] [c.30] [c.30] [c.31] [c.31] [c.32]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология