Карбоксипептидаза гидролиз

Рис. 43. Определение кинетических и равновесных параметров ингибирования к-бутанолом гидролиза гиппурового эфира Ь-аргинина, катализируемого карбоксипептидазой В, с помощью обработки значений каталитических констант (а) и констант Михаэлиса (б) в координатах уравнения (5.14)

Рис. 87. Необычный ход прямой, приводящий к отрицательным значениям кинетических параметров гидролиза бромацетил-ВЬ-фенил-лактата, катализируемого карбоксипептидазой, полученный при обработке полной кинетической кривой с помощью интегральной формы уравнения скорости

На рис. 15.15 приведена структура протеолитического фермента карбоксипептидазы А. Полипептидная цепь этого фермента образована 307 аминокислотными остатками и содержит один ион цинка. В цепи имеется несколько а-спиральных участков, а также несколько искривленных участков складчатого слоя (около центра молекулы). Каталитически активный центр фермента расположен рядом с атомом цинка. Пространственная структура части молекулы лизоцима (этот фермент, обнаруженный в слезах и яичном белке, защищает организм от инфекций, гидролизуя полисахариды клеточных стенок бактерий) вместе с [c.445]

Аналогичная ситуация реализуется, по-видимому, также и в ферментативных реакциях. Взаимодействие с субстратом одной функциональной группы белка может быть усилено за счет участия в реакции какой-либо другой, рядом расположенной группы нуклеофильного или электрофильного характера. Так, например, при гидролизе пептидной связи на активном центре карбоксипептидазы А см. схему на стр. 19) нуклеофильная атака молекулой воды усилена за счет общеосновного катализа со стороны карбоксильной группы остатка 01и-270 (а возможно и под действием гидроксильной группы остатка Туг-248). Общекислотный катализ осуществляет, по-видимому, Туг-248. Кроме того, расщепление пептидной связи субстрата может быть существенно облегчено в результате электрофильной атаки атомом 2п. [c.65]

В качестве иллюстрации смешанных типов ингибирования и активации ферментативных реакций можно привес+и данные по влиянию добавок н-бутанола на скорость реакций гидролиза сложноэфирного (рис. 79, а = 0,27, Р = 0) и пептидного (рис. 80, а = 0,2, Р = 2,3) субстратов карбоксипептидазой В, а также так называемое антиконкурентное (Р == О,/С = со,а/Сг з) влияние эффектора на катализ ацетилхолинэстеразой (рис. 81). [c.224]

Влияние н-бутанола на кинетику гидролиза гиппурового эфира Ь-аргинина, катализируемого карбоксипептидазой В. Условия опыта pH 8,0 23° С трис-ацетатиый буфер (0,025М) [Е]о = 6,05 10-5 иг/мл [c.93]

Рис. 79. Смешанный тип ингибирования -бутанолом гидролиза гип-пурового эфира /.-аргинина, катализируемого карбоксипептидазой В [7], если концентрация ингибитора, М

При изучении кинетики гидролиза пептидного субстрата, катализируемого карбоксипептидазой В, был обнаружен активирующий эффект добавок н-бутанола [10]. Исходя из данных табл. 19, предложить кинетическую схему реакции в предположении двухстадийного механизма действия фермента и рассчитать константу активации н-бутанолом. [c.97]

Рис. 42. Иллюстрация смешанного типа ингибирования к-бутанолом реакции гидролиза гиппурового эфира Ь-аргинина, катализируемого карбоксипептидазой В. Концентрации ингибитора (а)—0 (б)—0,05 М (в)— 0.15 М (г)—0,30 М

Рис. 102. Анализ кинетических данных гидролиза бромацетил-Ь, 1-фениляактата, катализируемому карбоксипептидазой [24], с помощью интегральной формы уравнения скорости (6.135)

В работе [10] было показано, что при увеличении концентрации субстрата в реакции гидролиза Ы-карбобензокси-Ь-трипто-фана, катализируемого карбоксипептидазой, скорость ферментативной реакции проходит через максимум, затем снижается и достигает постоянного уровня (табл. 6). Предложить схему реакции и определить значения ее равновесных и кинетических параметров. [c.119]

В присутствии таких Со(1П)-комплексов скорость гидролиза амидной связи увеличивается в 10 раз по сравиеиию со скоростью щелочного гидролиза. Подобное ускорение реакций сравнимо со скоростями, полученными для карбоксипептидазы А и ее субстратов. Отметим, что в процессе а, который, по-видимому, предпочтительнее процесса б в случае иона Со(П1), карбонильная группа поляризуется и гораздо легче атакуется молекулой воды извне, чем в отсутствие комплекса. Таким образом, ион металла опять-таки играет роль сверхкислоты. Другими словами, прямая поляризация карбонильной группы ионом металла создает более электрофильный центр на атоме углерода. Естественно, различные ионы металла в этом отношенпп обладают различными свойствами, зависящими в основном от их общего заряда, размера, координационного числа и легкости замещения (обычно) координированной молекулы воды. [c.358]

Рис. 58. Зависимость скорости гидролиза М-карбобензокси-Ь-триптофана, катализируемого карбоксипептидазой, от концентрации субстрата. Пунктирная кривая является теоретической при условии Р = О

С-Концы пептидных цепей определяются избирательным отщепле нием концевой аминокислоты с помощью специфического фермента — карбоксипептидазы и последующей идентификацией этой аминокислоты. Если макромолекула белка состоит из двух (или более) пептидных цепей, как в случае инсулина (см. рис. 53), то избирательно разрушают дисульфидные мостики окислением (например, надмуравьиной кислотой) и затем полученные полипептиды разделяют путем фракционирования на ионитах. Для определения последовательности расположения аминокислот в каждой полипептидной цепи ее подвергают частичному кислотному гидролизу и избирательному расщеплению с помощью ферментов, каждый из которых разрывает полипептидную цепь только в определенных местах присоединения какой-то одной определенной аминокислоты или одного типа аминокислот (основных, ароматических). Таким образом получают несколько наборов пептидов, которые разделяют, используя методы хроматографии и электрофореза. [c.376]

Из этих исследований механизма действия карбоксипептн-дазы А можно сделать следующие два вывода 1) 2п(И), по-видимому, связывается с карбонильной группой эфирных и амидных субстратов и 2) 01и-270 — также участник процесса, причем предполагается механизм как общего основного, так и нуклеофильного катализа. Существует также строгое доказательство того, что для эфиров и амидов механизмы различны. Следует обсудить также другой возможный механизм действия карбоксипептидазы А, включающий нуклеофильную атаку эфирной или амидной связи субстрата гидроксильным ионом, координированным цинком(И) Такая возможность тщательно изучена [223], в частности, на гидролизе карбоксилзамещенного эфира 8-оксихинолилглутарата в присутствии 2п(И). [c.350]

Рис. 80. Смешанная активация -бутанолом гидролиза гиппурил- -аргинина, катализируемого карбоксипептидазой В [7], если концентрация активатора, М

Известны и другие ферменты с различным специфическим действием. Так, карбоксипептидаза гидролизует пептиды или белки со свободной концевой карбоксильной группой за счет постепенного отщепления отдельных аминокислот, в то время как амииопептидаза, действуя аналогично, постепенно гидролизует пептид с другого конца, содержащего свободную аминогруппу. Ни один из этих ферментов пе гидролизует пептиды с циклической структурой. [c.297]

Расщепление карбоксипептидазой. pH 0,5 %-ного раствора исследуемого белка доводят до 8 в автотитраторе 0,01 и. NaOH под струей азота. Затем добавляют V30 часть ДИПФФ-обработанной карбоксипептидазы. Гидролиз длится 2—16 ч с отбором проб через каждые 60 мин. Пробы, содержащие по 0,2—0,3 мкмоля субстрата, депротеинизируют 1 объемом 10%-ной трихлоруксусной кислоты, осадок удаляют фильтрованием и фильтрат пропускают через колонку амберлита IR-4B в ацетатной ( юрме (0,5 х 5 см) для удаления трихлоруксусной кислоты. После этого раствор упаривают в вакууме, остаток растворяют в нескольких каплях дистиллированной воды и хроматографируют в системе бутанол — вода или исследуют на аминокислотном анализаторе. [c.292]

С-Концевую аминокислоту определяют, подвергая полипептид гидролизу с помощью фермента карбоксипептидазы. Этот фермент специфически гидролизует С-концевую амидную связь в пептиде или белке. По завершении гидролиза первой амидной связи карбоксипептидаза гидролизует следующую амидную связь и т. д. [c.522]

Дипептиды, т. е. соединения, у которых рядом находятся свободные аминная и карбоксильная группы, не могут быть гидролизованы ни аминопептидазой, ни карбоксипептидазой. Гидролиз пептидной связи в дипептидах катализируется дипептидазами [c.301]

Карбоксипептидазы гидролизуют пептидную связь, образованную С-концевым аминокислотным остатком. Существует две разновидности карбоксипептидаз карбоксипептидаза А и карбоксипептидаза В. Карбоксипептидаза А первоначально выделяется в виде прокарбоксипепти-дазы А, которая активируется трипсином. Карбоксипептидаза А отщепляет от пептида преимущественно С-концевые аминокислотные остатки с ароматическими боковыми цепями (механизм каталитического действия карбоксипептидазы А описан в главе 2). Карбоксипептидаза В также выделяется в неактивной форме затем, будучи активированной, она атакует С-концевые остатки, содержащие только аргинин и лизин. [c.377]

На рис. 73 приведена зависимость /х ) от 1/з для гидролиза пептидной связи карбобензилоксиглицилфенила-ланина, катализируемого ферментом карбоксипептидазой [c.260]

СООН) гидроксиламином показали, что в отсутствие 2п(П) гидроксиламин является эффективным нуклеофилом, способным атаковать ангидридную группу, но атака не катализируется 2п(И). Напротив, характер зависимости скорости гидролиза от pH указывает на то, что 2п(П) катализирует атаку ангидрида ОН-ионом, а не молекулой воды, и что этот процесс гораздо быстрее, чем некатали-зируемая атака гидроксиламином. Следовательно, связывание 2п(П) с ОН- (из Н2О) делает ион ОН- чрезвычайно эффективным нуклеофилом, с которым не может конкурировать даже такой хороший нуклеофил, как гидроксиламин. Напомним, что на первой стадии действия карбоксипептидазы 2п(11) [c.347]

Основываясь на своих собственных исследованиях модельных соединений, Бреслоу предложил второй механизм гидролиза пептидов карбоксипептидазой А, не включающий образования ацил-ферментного промежуточного соединения [221, 222]. По существу, в гидролизе пептидной связи участвуют ион цинка, карбоксильный ион и гидроксильная группа тирозина. 2п(П) ио-прежнему играет роль кислоты Льюиса, координируя карбонильный кислород, а карбоксильная группа действует скорее как общее основание. Это мож но утверждать, поскольку в присутствии СН3ОН (вместо воды) метанолиз пептидного субстрата не наблюдался из-за неблагоприятной константы равновесия. Таким образом, фермент не может включать метанол в переходное состояние (в реакции, катализируемой в обоих направлениях) ни в случае эфирных, ни в случае пептидных субстратов. Это означает, что для протекания гидролиза необходимо удаление в переходном состоянии обоих протонов молекулы воды. [c.348]

В связи с этим главный вопрос относительно предполагаемого ферментативного механизма действия карбоксипептидазы А состоит в стерической возможности и способности карбоксильной группы 01и-270 эффективно участвовать в нуклеофильной реакции. Фактически доказательство ее участия сейчас уже получено в спектроскопических исследованиях при температурах <0°С (—60°С) ковалентного ацилферментного промежуточного соединения, полученного при гидролизе субстрата О-(гранс-л-хлорциннамоил)-г-Р-фениллактата карбоксипептидазой А [224]. Более того, результаты свидетельствуют о том, что деацилирование промежуточного смешанного ангидрида катализируется связанной с цинком гидроксильной группой. [c.351]

Ионы кобальта также могут проявлять интересные каталитические свойства при гидролизе эфиров и амидов. Например, Со(1П) гораздо более эффективен, чем Zn(H), при поляризации карбоксильной группы пептидной связи. Однако было установлено, что карбоксипептидаза Л ката.лпзирует гпдролпз оензоплглицил-L-фенилаланина в 10 раз быстрее, чем это могло бы обеспечивать присутствие Со (III). Следовательпо, в случае фермента должен проявляться дополнительный эффект. [c.354]

Рис. 56. Ингибирование субстратом реакции гидролиза 0-бензоилглицин-2-оксиизовалериановой кислоты, катализируемой карбоксипептидазой А, Пунктирными линиями проведены ось симметрии кривой и правая ветвь теоретической кривой зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при условии

Именно этим можно объяснить, например, то, что при анализе кинетических данных для реакций гидролиза гиппурилфенилглицина и брома-цeтил-DL-фeниллaктaтa, катализируемых карбоксипептидазой, авторы [24] получили отрицательные значения и К т(каж)- Это видно из данных, приведенных на рис. 102, если анализировать их с помощью уравнения (6.135). [c.252]

Рис. 92. Зависимость скорости гидролиза карбобензилоксиглицилфенила-ланина под действием карбоксипептидазы от концентрации субстрата в координатах 1/у, 1/ (по данным Кауфмана и Нейрата)

Влияние н-бутанола на кинетику гидролиза гиппурнл-Ь-аргинина, катализируемого карбоксипептидазой В. Условия опыта pH 8,0 23° С, трис-ацетатный буфер (0,025М) [Е о = 1,21 10-< мг/мл [c.98]

Рис. 51. Смешанная активация н-бу-танолом гидролиза гиппурил-Ь-аргинина, катализируемого карбоксипептидазой В. Концентрации активатора (а)-0 (б)-2,5-10-2 М (в) 4-10-2 М (г) —1-10- М (д)— 3.3-10- М

Скорость реакции гидролиза 0-(бензоилглицин)-2-оксиизо-валериановой кислоты, катализируемой карбоксипептидазой А, [c.118]

Зависимость скорости гидролиза N-кapбoбeнзoк и-L-тpиптoфaнa, катализируемого карбоксипептидазой, от концентрации субстрата. Условия опыта pH 7,5 5° С 0,04М фосфатный буфер 0,5М КС1 [c.119]

Рис. 57. Обработка кинетических данных по неполному ингибированию субстратом реакции гидролиза О- (беизоилглицин) -2-оксиизовалериа-новой кислоты, катализируемой карбоксипептидазой А

Анализируя полную кинетическую кривую гидролиза гип-пурилфенилглицина, катализируемого карбоксипептидазой, авторы [7 получили отрицательные значения и Кт(каж). Дать объяснение полученным результатам. [c.174]

В таблице 7 приведены кинетические данные для гидролиза бромацетил-ВЬ-фениллактата, катализируемого карбоксипептидазой [7]. Найти значение константы конкурентного ингибирования продуктом реакции, если значения йкат и Кт(кат), определенные из начальных скоростей ферментативной реакции, равны 57,4 сек и 1,6 10 М соответственно. [c.174]

Кинетика накопления продукта гидролиза бромацетил-ОЬ-фениллактата, катализируемого карбоксипептидазой. Условия опыта pH 7,5 [c.175]

В этом уравнении указана только концевая часть пептидной цепи. Карбоксипепти-даза атакует только амидную группу иа конце цепи. Однако ее активность не зависит от природы боковых цепей К и К. Карбоксипептидазы катализируют гидролиз пептидов, но не обладают никакой активностью в гидролизе жиров последнюю реакцию катализирует совершенно другая группа ферментов. Присущая ферментам высокая степень специфичности необходима для того, чтобы все реакции, протекающие в сложных организмах, были в определенной мере независимы друг от друга. [c.451]

ПРОНАЗА, смесь частично очищенных протеолитич ферментов из микробов 31гер1отусе5 gri.seus, содержащая нейтр. и щел. протеиназы (см. Протеолитгтеские ферменты), а также протеиназы, близкие по характеру действия химотрипсину и карбоксипептидазам. Мол. м. компонентов 16 000—20 ООО. Обладает широкой субстратно специфичностью, при pH 7—8 гидролизует в казеине и альбумине 80—85% пептидных связей. Активность разл. комнонентов П. подавляется хелатами, диизопропилфторфосфатом, хлоркетонами. Активизируется Са +, Со +, Мп +, Примен. при исследовании строения белков ПРОПАЗИН. триазин [c.480]

На рис. 92 приведена зависимость 1/и от 1/5 для гидролиза пептидной связи ка-рбобензилокситлицилфенилаланина, катализируемого карбоксипеПтидазой [c.331]

Рис. 93. Зависимость скорости гидролиза карбобензилокснглнцнлфенилала-н-ина под действием карбоксипептидазы от коицентрации субстрата без ингибитора (/), в присутствии 0,002. М фени-луксусной кислоты (2) в присутствии 0,002 М фенилиропионовой кислоты (3) (по данным Кауфмана и Нейрата)

Для увеличения скорости отщепления остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот карбоксипептидазой А рекомендуется проводить гидролиз при pH 4,7. [c.154]

Для полного воссоздания первичной структуры полипептида необходимо идентифицировать аминокислоты, которые входят в состав каждого из фрагментов, получепных в результате неполного гидролиза, и решить, в какой последовательности эти аминокислоты соединяются друг с другом в исходном полипептиде. Один из подходов к решению этой проблемы состоит в том, что проводят полный гидролиз фрагментов, идентифицируют составляющие их аминокислоты, а затем осуществляют химический синтез фрагментов. Другой путь — избирательный гидролиз, при котором от фрагмента отщепляют по одной аминокислоте на каждом этапе, чаще всего при помощи ферментов из подл елудочной железы, так называемых карбоксипептидаз. Эти ферменты способны гидролизовать только С-концевые аминокислоты и, следовательно, постепенно разрушать нептидный фрагмент с С-конца. Нередко достаточно бывает проанализировать различные концентрации аминокислот полученных под действием карбоксипептидазы, которая гидролизовала фрагмент в течение постепенно возрастающих промежутков времени, чтобы получить необходимые данные относительно аминокислотной последовательности. [c.403]

Для определения С-концевых остатков чаще всего используют ферментативный гидролиз карбоксипептидазами, к-рые специфически расщепляют пептидные связи, образованные С-коицевыми остатками. Поскольку после отщепления концевых остатков фермент атакует послед, пептидные связи, измерение скорости отщепления отдельных аминокислот позволяет анализировать также и С-концевую аминокислотную последовательность. [c.250]

Иягибировавие ферментативных реакций м. б. обратимым и необрати.мым. В обоих случаях И, способен к образованию комплекса с ферментом, но не м. 6. подвергнут каталитич. превращению и препятствует образованию комплекса фермент-субстрат. Напр., бутанол ингибирует гидролиз сложных -эфиров, катализированный карбоксипептидазой. Различают след, случаи обратимого ингибирования. [c.221]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология