Культивирование каллусов

Вторичная дифференцировка каллусной клетки может завершиться образованием в каллусной ткани отдельных дифференцированных клеток. Они имеют определенное строение и выполняют специфические функции. Примером служит образование эпибла-стов — клеток, в которых запасаются вторичные метаболиты. Это наиболее простой тип дифференцировки каллусной клетки. Более сложная гистологическая дифференцировка завершается образованием в каллусе различных тканей млечников, волокон, трихом, элементов ксилемы (трахеи и трахеиды) и флоэмы (ситовидные трубки и клетки-спутницы). К самым сложным видам вторичной дифференцировки относятся органогенез — образование органов и соматический эмбриогенез — образование из соматических клеток эмбриоидов, биполярных зародышеподобных структур. Все эти типы дифференцировки возможны только благодаря тотипотентности любая растительная клетка содержит полный набор генов, характерный для того организма, из которого она была вьщелена. Потенциальные возможности всех клеток этого растения одинаковы каждая из них в определенных условиях может дать начало целому организму. Однако выяснено, что реально детерминируется только одна из 400—1000 клеток, что, вероятно, связано с физиологическим состоянием клетки, с ее компетентностью. Так, у эксплантов стеблевого происхождения компетентны к действию экзогенных фитогормонов и, следовательно, способны к морфогенезу только клетки эпидермальных и субэпидер-мальных тканей (Тран Тан Ван, 1981). Однако компетентность клеток может приобретаться ими в процессе культивирования [c.173]

Существует также суспензионная культура клеток, которую выращивают в жидкой питательной среде, так называемое глубинное культивирование. Клеточные суспензии образуются как из каллусных тканей, так и непосредственно из экспланта. Для получения суспензионных культур предпочтительнее брать каллусы рыхлого типа. Если для этой цели необходимо использовать плотный каллус, то его можно разрыхлить, исключив из питательной среды соли Са " . С этой же целью можно культивировать ткань на среде, содержащей ауксин 2,4-В или ферменты — пектиназу (0,2 мг/л) и [c.166]

В культуре каллуса клеточное деление происходит беспорядочно во всех направлениях, и возникает неорганизованная масса ткани следовательно, в каллусе нет вполне определенных осей полярности. В меристеме побега илн корня, напротив, мы наблюдаем высокоорганизованное строение ткани, и характер деления строго упорядочен. Было обнарулеено, что при некоторых условиях культивирования в каллусе образуются стеблевые или корневые меристемы и в результате регенерируют новые целые растения. [c.240]

Взаимосвязь процессов и биообъектов Биообъекты характеризуются такими показателями, как уровень структурной организации, способность к размножению (или репродукции), наличие или отсутствие собственного метаболизма при культивировании в подходящих условиях Что касается характера биообъектов, то под этим следует понимать их структурную организацию В таком случае биообъекты могут быть представлены молекулами (ферменты, иммуномодуляторы, нуклеозиды, олиго- и полипептиды, и т д), организованными частицами (вирусы, фаги, вироиды), одноклеточными (бактерии, дрожжи) и многоклеточными особями (нитчатые высшие грибы, растительные каллусы, однослойные [c.233]

Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене, [c.143]

Обычно в основе вегетативного размножения растений лежит способность эмбриональной ткани меристемы (гл. 1, разд. Д. 4) дифференцироваться в корни и побеги. С другой стороны, при культивировании изолированных клеток флоемы или других дифференцированных тканей, как правило, формируется так называемый каллус, т. е. масса претерпевших дифференцировку клеток, напоминающих эмбриональные. При создании благоприятных условий, в частности при культивировании в среде, содержащей кокосовое молоко, а также при соблюдении соответствующего соотношения концентраций ауксина и цитокинина удавалось индуцировать реверсию, т. е. превращение клеток флоемы корня моркови в эмбриональные клетки, из которых затем развивалось целое растение [136]. Этот опыт имеет принципиальное значение, так как определенно доказывает, что дифференцированные клетки флоемы моркови содержат полный набор генов, необходимых для развития растения. Вместе с тем существенно и то, что с большинством растений такого рода опыт воспроизвести довольно трудно и процесс дедифференцировки далеко не всегда происходит автоматически. Все же это происходит в достаточном числе случаев, чтобы установить факт тотипотентности ядра дифференцированных клеток. [c.354]

Цели создания ассоциаций с отдельными микроорганизмами существенно различаются так же, как и критерии, на основе которых оценивается возникновение ассоциативных взаимодействий в системах. Общим принципом для создания ассоциаций является совместное культивирование клеток и каллусных тканей растений с микроорганизмами. При этом способы введения микроорганизмов в систему для совместного выращивания могут быть разными внесение клеток микроорганизмов непосредственно в каллусную или суспензионную культуру растения (смешанные культуры) высев на поверхность агаризованной среды рядом с каллусом таким образом, чтобы рост микроорганизмов происходил без соприкосновения (совместные культуры) разделение бактериальных клеток и клеток суспензионной или каллусной культуры специальными фильтрами (мембранами), обеспечивающими обмен продуктами метаболизма, но не допускающими контактов между клетками партнеров. [c.61]

Рост каллусных тканей и побегов растений в ассоциации с цианобактериями в условиях дефицита связанного азота. Выявлены преимушества роста ассоциаций с азотфиксирующими цианобактериями каллусных тканей растений при дефиците или полном исключении из среды азота. Так, при 20%-ном (от нормы) содержании в среде МС азота прирост биомассы каллуса табака в смешанной культуре был на 25—30% выше, чем в монокультуре. Кроме того, при длительном культивировании без пересадок на дефицитной по азоту среде жизнеспособными оставались только участки ткани, соприкасающиеся с зонами роста цианобактерий. [c.85]

В отличие от этого каллусы, полученные на сегментах стеблей молодых вегетирующих растеиий табака Трапезонд и выращиваемые в тех же условиях культивирования, регенерируют только вегетативные ночки и не образуют бутонов (рис. 145, в). Вегетативное направление органогенеза у этих каллусов устойчиво сохраняется в течение длительного культивирования каллусов в различных условиях и ири внесении в культуральную среду различных веществ. [c.256]

При полном исключении из среды В5 связанного азота каллус люцерны в монокультуре не рос при совместном его культивировании с цианобактериями биомасса каллуса в 2,7 раза превышала биомассу каллуса в монокультуре (рис. 41). В совместной культуре через 10 сут роста практически все клетки люцерны (94%) были живыми, тогда как в монокультуре — только 54%. В данном опыте была использована в отличие от приводимых [c.85]

Регенерация обычно с трудом происходит из трансформированных недифференцированных тканей, полученных из культивируемых более нескольких месяцев клеток суспензии, а еще с большим трудом из каллусов, полученных из протопластов [3, 28]. Таким образом, прежде чем осуществлять трансформацию любой разновидности растений, чрезвычайно важно определить наиболее чувствительный эксплантат. Для. многих культурных видов главной трудностью остается трансформация клеток, способных регенерировать побеги ( органогенез ) или способных к эмбриогенезу, и поэтому большинство методов разработано в результате экспериментов на модельных системах культуры тканей, таких, как табак и петуния. Для ясности большинство из рассматриваемых ниже методик основано на использовании именно таких модельных систем. В целом все основные манипуляции с культурой ткани должны быть действенными для успешной разработки системы трансформации конкретных видов растений. Информация относительно культивирования тканей многих видов содержится в следующих литературных источниках [4, 24, 25, 26, 70, 83]. [c.105]

Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фосфата способствует быстрому росту клеток. Истощение среды значительно снижает рост и процессы вторичного метаболизма. Однако изначально низкое содержание фосфатов в питательной среде способно стимулировать синтез вторичных метаболитов. Установлено, что культивирование каллусов солодки голой на среде с половинной концентрацией азота и фосфора в темноте увеличивает содержание фенольных соединений в 1,6 раза по сравнению с каллусами, растущими на полной среде. В среду могут бьггь добавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосовый орех, конский каштан и др.), пасока некоторых деревьев, различные экстракты (солодовый, дрожжевой, томатный сок). Введение их в среду дает интересные результаты, но такие эксперименты трудно воспроизводимы, так как действующий компонент, как правило, точно неизвестен. Например, добавление в прггательную среду отдельных фракций кокосового молока не давало никаких результатов, в то время как нефракционированный эндосперм вызывал деление клеток. [c.162]

Культура растительных клеток является искусственно созданной биологической системой, функционирующей in vitro и сохраняющей многие черты, присущие интактному растению. Имеется два варианта функционирования таких систем в виде каллуса, образовавшегося в процессе поверхностного культивирования, а также в виде суспензии клеток в результате глубинного культивирования. Каллус — весьма гетерогенное образование (рис. 31.2). Он представляет собой совокупность недифференцированных клеток, способных синтезировать некоторые метаболиты, присущие целому растению. [c.496]

Каллусы, полученные на стеблевых сегментах, взятых из главной оси соцветия взрослых цветущих растепий табака Т]Шпезоид, характеризуются сильно вырал ениой тенденцией к флоральному морфогенезу и преимущественно (в 85—90% случаев) образуют тенеративные ночки с развивающимися из них бутонами и цветками (рис. 145, а). Способность к генеративному морфогенезу устойчиво сохраняется при длительном культивировании каллусов вместе с исходным сегментом. При этом па каллусах постепенно формируются все новые бутоны и цветки, общим числом. до 30 иа одии каллус за 7 мес культивирования (рис. 145,6). [c.256]

Несомненный интерес у исследователей вызывает вопрос, связанный с происхождением адвентивных почек, и, в частности, какие клеточные слои участвуют в дифференциации меристем. Единого мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран Тан Ван в своих работах с тканями табака показала, что именно эпидермис является наиболее активной тканью, способной образовывать почки, каллус или корни в зависимости от гормонального баланса питательной среды. Цитологические исследования, проведенные на сегментах базальной части донца луковиц тюльпанов и нарциссов показали, что адвентивные побеги формируются из поверхностных слоев меристематических клеток, прилегающих к донцу, а для растений глоксинии процесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в субэпидермальных клеточных слоях листовых пластинок. Единого мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей, работающих с древесными растениями. Так, было показано, что образование почек на изолированной хвое ели обыкновенной происходит в эпидермальном слое культивируемого экспланта, для псевдотсуги — в субэпидермальных слоях, а при культивировании семядолей сосны замечательной на среде, содержащей один цитокинин (БАП), этот процесс происходит одновременно как в эпидермальном, так и в субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было отмечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпидермальном слоях семядолей [c.113]

Однако, несмотря на некоторые недостатки, данный метод имеет положительные стороны и преимущества. Во-первых, он является эффективным и экономически выгодным, так как в процессе размножения из каждой индивидуальной каллусной клетки при благоприятных условиях культивирования может сформироваться адвентивная почка, дающая начало новому растению. Во-вторых, в ряде случаев он является единственно возможным способом размножения растений в культуре тканей. В-третьих, представляет большой интерес для селекционеров, так как растения, полученные данным методом, различаются генетически и морфофизиологически. Это дает возможность селекционерам проводить отбор растений по хозяйственно-важным признакам и оценивать их поведение в полевых условиях. Этот метод целесообразно применять лишь к тем растениям, для которых показана генетическая стабильность каллусной ткани, а вариабельность между растениями-регенерантами не превышает уровня естественной изменчивости. К таким растениям можно отнести амариллис, томаты, спаржу, некоторые древесные породы и другие культуры. Через каллусную культуру были размножены сахарная свекла, некоторые представители рода Brassi a, кукуруза, рис, пшеница и другие злаковые, подсолнечник, лен, разработаны условия, способствующие регенерации растений из каллуса огурца, картофеля, томатов. [c.115]

Для растений хмеля было показано, что изолированные апексы различных сортов по-разному реагируют на присутствие в питательной среде регуляторов роста для сорта Смолистый оптимальной была концентрация БАП 1 мг/л, для сорта Истринский-15 — 0,5— 1,5 мг/л БАП и 0,05 мг/л ИУК. Апексы сорта Смолистый не реагировали на добавление в питательную среду ИУК и 2,4-Д, а у сорта Истринский-15 увеличивался рост побегов на среде с 0,05 мг/л ИУК и 0,05 мг/л 2,4-Д. Для изолированных апексов крыжовника также были отмечены сортовые различия в морфогенетических реакциях на условия культивирования. Так, апексы, культивируемые на питательной среде, содержащей минеральные соли по Т. Мурасига и Ф. Скуга, БАП 0,5 мг/л сорта Финик пролиферировали каллус, из которого затем формировались побеги, а апексы сортов Русский, Колобок, Розовый обладали способностью к прямой регенерации побегов. [c.124]

НИИ молекулярных механизмов дедифференцировки, действия гормонов и других факторов, индуцирующих деление, небезразлично, в какой фазе клеточного цикла данная клетка перешла к дифференцировКе, т. е. с какой фазы ей предстоит двигаться повторно по циклу. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. Так, взятый целиком фрагмент стебля имеет в своем составе клетки — эпидермальные, первичной коровой паренхимы, камбия и сосудистой системы, сердцевинной паренхимы. В разных условиях культивирования и в зависимости от различий в физиологическом состоянии исходного растения можно наблюдать преимущественную пролиферацию клеток камбия и его молодых дериватов, коры и сердцевинной паренхимы. Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани, так как некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации или эпигенетически наследуемые признаки. [c.15]

В клетках экспланта, состоящего из неделящихся, специализированных клеток, в самом начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматическими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к процессу деления. Для разделения этих процессов можно рекомендовать прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в течение 3—6 сут. Это позволяет исключить не только изменения, связанные с травмой, но и возможное не контролируемое влияние эндогенных гормонов экспланта на изучаемые процессы. При соблюдении указанного условия становится ясной роль в индукции клеточного деления фитогормонов группы ауксинов и цито-кининов, дедифференцировке специализированных клеток и в поддержании каллусных клеток в делящемся состоянии, приводящем к образованию первичного каллуса. При этом наблюдаются сложные взаимодействия между ауксинами и цитокинина-ми. Присутствие в среде одного ауксина определяет переход специализированной клетки из покоящейся фазы Со к вступлению в 5-фазу клеточного цикла. Однако для завершения фазы синтеза ядерной ДНК, синтеза белков, стимулирующих переход [c.15]

Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4—6 недель (в зависимости от темпов роста), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Размер транспланта (переносимого кусочка) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно колеблется от 60 до 100 мг массы ткани на 30—40 мл питательной среды. [c.17]

Резюмируя, можно отметить, что техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную, пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интакт-ного растения. Клетки различно дифференцированные (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу дедифференцнации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус. [c.17]

Разработка способов индукции слияния протопластов вместе с развитием экспериментальной техники культивирования клеток in vitro, дающей возможность получения изолированных протопластов, их культивирования и образования каллуса и в дальнейшем целого растения, сформировало новый очень интересный и перспективный метод гибридизации растений — парасексуаль-ную, или соматическую, гибридизацию. [c.46]

Начальное культивирование проводилось при низкой интенсивности света. В этот период происходило деление и образование клеточных группировок обоих мутантов и гибридных протопластов. Каллусы, которые при этом развивались, подвергались селективному воздействию света высокой интенсивности. Только гибридные клетки и каллусы, образовавшиеся из них, оказались устойчивыми к условиям высокой освеш,енности. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что путем поглощения ядра между двумя светочувствительными мутантами образовались гибридные формы клеток (I. Potrykus et al., 1977). [c.50]

Ассоциация с зеленой водорослью. Инокуляция каллуса моркови одним из штаммов hlorella и культивирование системы на дефицитной по азоту среде на свету приводила к выживанию каллуса в течение нескольких месяцев, в то время как контрольный каллус погибал. Клетки водоросли росли на поверхности каллуса и проникали в межклетники. В инокулированном каллусе обнаружен высокий процент интактных клеток, и большинство из них, очевидно, были живыми. Клетк11 другого штамма водоросли не росли совместно с каллусом, и в их присутствии обнаружена очень низкая доля интактных клеток моркови. На основании проведенных экспериментов сделан вывод об обеспечении клеток моркови азотистыми веществами, поступающими от водоросли, при культивировании системы на среде с дефицитом азота. [c.66]

Ассоциации с грибами. Способ совместного культивирования ткани руты с различными грибами был применен в качестве нового, нетрадиционного подхода к повышению биосинтеза видоспецифических продуктов, образуемых растительными клетками m vitro (В. Wolters, U. Eilert, 1982). Совместную культуру получали таким образом, чтобы каллус и мицелий гриба не соприка- [c.66]

Особенности цианобактерий в качестве партнера растительных клеток в искусственных ассоциациях. В исследованиях по получению ассоциаций на основе изолированных протопластов (см. табл. 4) были сделаны попытки введения цианобактерии в изолированные протопласты. Кроме того, выполнены единичные работы по совместному культивированию цианобактерий с растительными тканями (см. табл. 5). При этом было показано сох ранение интактности клеток каллуса моркови в условиях осве щенности на среде, дефицитной по азоту, при совместном культивировании с азотфиксирующими цианобактериями Апо [c.67]

Подходящими эксплантатами считаются целые стерильные проростки, эксплантаты проростков (например, гипокотили, семядоли, листья и корни), эксплантаты выращенной в теплице рассады, более зрелые или размножаемые in vitro растения (например, корень, стебель, лист, черешок, фрагменты цветковых и запасающих органов). Состав используемых сред в какой-то мере зависит от вида растения и типа эксплантата. Например, для роста проростков или эксплантатов побегов может подойти среда, используемая для поддержания культуры побегов того же вида растения. С другой стороны, фрагменты запасающих тканей (клубней, главных корней) часто сохраняют жизнеспособность в течение нескольких недель при культивировании на агаризованной среде, содержащей только неорганические соли. У большинства видов растений корончатые галлы или косматые корни развиваются на больших эксплантатах, культивируемых на простых средах, не содержащих фитогормонов. Главное требование к ростовой среде, используемой при трансформации и развитии опухоли, заключается в том, чтобы она обеспечивала жизнеспособность эксплантата при ограниченном образовании каллуса. При использовании небольших эксплантатов в состав среды можно включить и микродобавки ростовых веществ, чтобы сохранить эксплантат и обеспечить ограниченное деление окружающих рану клеток во время инкубации с агробактериями. Проблему выживаемости эксплантата можно решить, [c.108]

Приступить к эксперименту по трансформации с помощью неонкогенных векторных систем следует после выбора подходящих эксплантатов и условий инокуляции и селекции, позволяющих получать резистентные к антибиотику каллусы с помощью онкогенных штаммов агробактерий и угг-помощников (описанных в разд. 2.2). Необязательно, что условия, дающие эффективную трансформацию определенного эксплантата с помощью онкогенной векторной системы, подойдут для трансформации с помощью неонкогенных векторов. Неонкогенные ткани гораздо чувствительнее к условиям культивирования, поскольку в них, очевидно, не проявляются физиологические и ростовые свойства ткани корончатых галлов и косматого корня. И в этом случае подходящие комбинации угг-систем, хозяйских штаммов агробактерий и селективных генов можно установить только эмпирически. [c.117]

Трансформированные побеги можно регенерировать через стадию каллуса. В этом случае с помощью культивирования на соответствующей селективной среде на эксплантатах получают каллусы. Затем из установившихся трансформированных тканей (каллусных или суспензионных культур) индуцируют индивидуальные побеги путем эмбрио- или органогенеза на среде для регенерации. Стратегия включает, во-пер-вых, регенерацию в присутствии селектирующего агента и, во-вторых, без селектирующего агента с последующим укоренением в его присутствии или скринингом на экспрессию маркерного гена. [c.118]

Агаризованная среда для совместного культивирования (например, MSD4X2) и та же среда, содержащая бактерпоста-тический антибиотик (например, Сх) и/или селективный агент (например. Km) для подавления роста агробактерий и отбора трансформированных каллусов. Например [c.135]

Неудачи в экспериментах по трансформации культурных видов растений, как правило, обусловлены трудностями в их культивировании in vitro и не связаны с неадекватностью векторной конструкции. Трансформация протопластов имеет ограниченное применение, поскольку только немногие экономически важные виды можно легко регенерировать из тканей, полученных из протопластов. Однако у многих сельскохозяйственных растений возможна регенерация из каллуса и клеток суспензионной культуры как путем органогенеза [28], так и соматического эмбриогенеза [3]. Поэтому предпринимаются большие усилия по разработке эффективных систем трансформации для этих тотипотентных клеток культурных растений [5, 62, 65]. [c.160]

Трансформация агробактериями. В зависимости от цели экспериментов и степени изученности объекта возможны несколько способов трансформации растительных клеток агробактерия ми и регенерации из них целых растений. Простейший из способов предложен дня модельных растений (Hors h et а , 1985). Из молодых листьев готовят диски размером несколько миллиметров, стерилизуют их поверхность и инокулируют в жидкую среду, которая содержит агробактерии, несущие рекомбинантные векторы. При этом происходит инфицирование растительных клеток, находящихся на краях диска. После двух дней культивирования диски переносят на плотную среду с карбенициллином (убиение агробактерий), канамицином (отбор растительных Ю1еток, приобретших ген neo) и высоким содержанием циго-кинина (индукция образования побегов). На этой среде сначала в отдельных местах по краям диска происходит образование каллуса, из которого через 2—4 недели развиваются побеги (рис. 12.4,а). Затем каллус с побегом отделяют и переносят на среду с повышенным содержанием ауксина, индуцируя образование корней. Через дополнительные 2—4 недели растение переносят в почву. [c.380]

При перенесении их на агаризованную среду образуется каллус, из которого при определенных условиях культивирования и состава греды может быть получено целое растение. [c.175]

Техника культивирования каллусных тканей. Большинство эксплантатов образуют первичный каллус, который можно субкультиви-ровать, через 6—8 нед. В асептических условиях каллус следует перенести пинцетом в стерильные чашки Петри, скальпелем отделить каллусную ткань от исходного эксплантата или некротических участков в центре и на нижней стороне каллуса и, разделив каллус на несколько кусочков (5X5 мм), перенести на свежую питательную среду. (Рекомендуется положить кусочек срезанной поверхностью на агар и осторожно прижать его к среде. Использованные пинцеты и скальпели опускаются в 96 %-ный спирт и в процессе работы обжигаются в пламени спиртовки и остужаются между листами стерильной бумаги. [c.240]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология