Кристаллизация ферментов

Изменение температуры заметно влияет на скорости реакций, катализируемых ферментами. По мере повышения температуры, начиная с комнатной, скорость реакции для данной начальной смеси возрастает, что вообще свойственно химическим реакциям. Однако уже при весьма умеренных температурах скорость перестает возрастать и при более высокой температуре падает. Температура, при которой скорость реакции максимальна, изменяется в зависимости от состава смеси и pH раствора. При повышенных температурах скорость падает очень быстро, и этот факт приписывают инактивированию фермента путем денатурации. При данной температуре скорость денатурации минимальна нри вполне определенной величине pH, причем она быстро возрастает для предельных значений pH. Эта денатурация вызывает определенные изменения и в других свойствах, помимо изменений в реакционной способности может происходить уменьшение растворимости и облегчаться кристаллизация фермента. В молекулярном масштабе существует возможность значительного изменения формы молекулы фермента путем разрыва водородных и аналогичного тина связей [c.136]

Кристаллизация ферментов. Первым по времени (1833) был выделен из солода диастаз, вскоре после этого (1862) А. Я. Данилевским были выделены и исследованы ферменты пищеварительного тракта. Затем последовало выделение целого ряда различных ферментов, но все они были сильно загрязнены примесями. Путем адсорбции л элюции удалось значительно очистить ферменты, но первый фермент [c.339]

Вполне уместно завершить эту книгу разделом о кристаллизации ферментов, поскольку получение кристаллов част представляет собой конечную стадию очистки и изучения фермента. Часть этого раздела следовало бы поместить в гл. 3,, потому что кристаллизация как метод осаждения—это очень-хороший и часто используемый способ очистки ферментов. Но-все же более уместно обсудить его в общих чертах в этом разделе. Кристаллизация играет важную роль в научных исследованиях по меньшей мере четырех типов она используется -1) как метод очистки ферментов, 2) для подтверждения гомогенности ферментных препаратов, 3) как метод стабилизации ферментов при хранении и 4) для определения третичной структуры ферментов методом рентгеноструктурного анализа. [c.332]

Для окончательного фракционирования белков используют также электрофорез, в основе которого лежит разделение кислых и основных молекул белков по их заряду в электрическом поле. Ферменты при достаточной степени очистки их раствора можно получить и в кристаллическом виде. Кристаллизацию ферментов проводят из растворов сульфата аммония, спирта или органических растворителей. К концентрированному раствору фермента осторожно по каплям добавляют насыщенный раствор сульфата аммония или спирт до появления едва заметной мути. Затем раствор на несколько дней оставляют на холоде. Выпавшие кристаллы отделяют и ведут перекристаллизацию до тех пор, пока продолжает увеличиваться активность фермента. [c.203]

Получение фермента в очищенном состоянии заключается в выделении его из клеток и тканей, отделения от сопутствующих ферментов и инертных веществ и, наконец, кристаллизации фермента. [c.49]

Используют инвертазу также для предупреждения кристаллизации высококонцентрированных меласс в производстве искусственного меда, при выработке ликеров, замороженных кремов, где высокие концентрации сахарозы также могут приводить к кристаллизации. Фермент применяют при выработке слоистых шоколадных изделий. Здесь, как и в производстве конфет с мягкой кремовой начинкой, изделия формируют и наносят слои тогда, когда смеси имеют твердую (плотную) консистенцию, после чего постепенно, в результате ферментного процесса, образуется мягкий стабильный крем там, где он необходим. К сказанному можно добавить, что применение инвертазы создает возможность механизации ряда ручных процессов, облегчает обработку многих [c.236]

Кристаллизация. После аффинной элюции можно провести кристаллизацию фермента. Элюат, содержащий глюкозофосфатизомеразу, диализуют в течение ночи против насыщенного сульфата аммония, приготовленного на 25 мМ триэтаноламине, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол, pH 8,2. Осадок собирают центрифугированием и растворяют в том же буфере разводят до концентрации белка 10 мг/мл. К раствору белка медленно на холоду добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 48%-ного насыщения. Выпавший при этом аморфный осадок удаляют. Раствор белка оставляют а ночь при комнатной температуре для кристаллизации. [c.237]

Каждый биохимик, получив исследуемый фермент в кристаллическом виде, испытывает большое и вполне законное удовлетворение. Однако не следует забывать, что одна только кристаллизация фермента не может служить полной гарантией его чистоты. Так, Джекоби, в лаборатории которого за три года было выделено в кристаллическом виде 50 белков [7], сообщил о кристаллизации препаратов всего лишь 30%-ной чистоты. Он еще раз подчеркнул необходимость применения иных критериев гомогенности, таких, например, как ультрацентрифугирование и электрофорез. Однако следует иметь в виду, что при некритичном отношении к постановке эксперимента и на ультрацентрифуге можно получить один пик для гетерогенной смеси. На скорость седиментации частиц в центробежном поле и характер получающихся на седиментационных диаграммах пиков влияет ряд факторов, которые рассматриваются в настоящей книге и которыми некоторые исследователи часто на собственный риск пренебрегают. Именно по этой причине, несмотря на большие возможности применения этого метода в упомянутых выше областях, во многих лабораториях к работе на ультрацентрифуге допускается лишь ограниченный круг лиц, умеющих правильно использовать приборы и интерпретировать получаемые данные. Люди, владеющие этими знаниями, охотно принимаются в исследовательские коллективы, и можно надеяться, что предлагаемая книга послужит увеличению числа таких специалистов. Материал, изложенный в данной книге, рассмотрен достаточно глубоко, но вместе с тем не слишком сложно, что является результатом многолетнего опыта замечательного лектора, читающего курс физико-химических концепций студен-там-биохимикам. [c.10]

Ионы металлов редко применяют как единственный способ очистки, а чаще в сочетании с другими методами, такими как фракционирование при помощи солей или спиртов. Иногда тяжелые металлы используют для осаждения балластных белков из ферментного препарата это можно делать только тогда, когда доказано специфическое сродство металла к определенным реакционноспособным группам некоторых типов белковых молекул. Благодаря такой специфичности металлы, подобранные соответствующим образом, можно использовать также для улучшения кристаллизации ферментов из смеси или для их дробного осаждения. [c.148]

Наряду с использованием сульфата аммония существуют иные способы кристаллизации ферментов, например из раствора спирта (ал-когольдегидрогеназа печени), ацетона (уреаза) и др., [c.205]

Перекристаллизация. Суспензию центрифугируют (20 мин при 12 000 ). Кристаллический осадок растворяют в 1 мМ ЭДТА, содержащем 0,2 мМ ДТТ. Нерастворившийся осадок отбрасывают, к раствору добавляют сульфат аммония до насыщения 0,55. Это вызывает кристаллизацию фермента. Через несколько дней кристаллы отделяют центрифугированием, взбалтывают в небольшом объеме полунасыщен-ного раствора сульфата аммония и хранят в виде суспензии на холоде. [c.274]

Успехи, достигнутые с помощью различных экспериментальных подходов в изучении гликолиза, показывают, что прогресс в выяснении метаболических процессов зависит от развития методов, с помощью которых биохимические лоследовательности можно расчленить на отдельные звенья. Конечной целью такого подхода является выделение и кристаллизация ферментов, катализирующих каждую отдельную реакцию. Необходимость применения этих методов вытекает из наличия чрезвычайно сложного переплетения ферментативных процессов. Но именно это обстоятельство и создает парадоксальную ситуацию поскольку различные метаболические последовательности связаны друг с другом, функционирование любой из них может зависеть от остальных. Это значит, что мы не сможем полностью оценить физиологической роли [c.16]

Иногда для экстракций используются комбинации растворителей, применяемых последовательно или совместно. Так, в классических работах Осборна растительные белки выделяли последовательной экстракцией водой, разбавленными растворами нейтральных солей и разбавленными щелочами. Для экстрагирования ферментных и иных белков из трав использовали смесь зфир — вода. Для выделения из животных тканей миофибриллярных белков их извлекали, например, 1,1М иодистым калием и 0,1М калий-фосфатным буфером. Успех первой кристаллизации фермента (уреазы), возможно, определила экстракция водно-ацетоновой смесью. Для приготовления смеси брали 158 мл ацетона и разбавляли до 500 мл водой. Охлажденный раствор приливали к 100 г муки канавалии. Суспензию перемешивали, фильтровали и оставляли стоять 18 ч при 2°С. За это время из раствора выпадали кристаллы уреазы, которые отделяли центрифугированием и промывали 32%-ным ацетоном. Примерно также, с помощью 35%-ного водного раствора диоксана, извлекали каталазу из бычьей печени. [c.142]

Ванадат, образующий с АТФазой нековалентный комплекс, обеспечивает кристаллизацию АТФазы и стабилизирует фермент в 2-конформации. Лантаниды также потенциируют кристаллизацию фермента, но переводят его в гконформацию. Различие между кристаллизационными формами фермента состоит в том, что в первом случае фермент находится в форме димера, во втором — преимущественно в виде мономеров. [c.60]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология