Ферменты очистка, метод адсорбционный

Для очистки и выделения белковых веществ — ферментов — применяются методы адсорбционного фракционирования, являющиеся наиболее эффективными. [c.148]

В то же время Вильштеттер отмечал, что удаленне из препаратов белковых веществ влечет за собой снижение стабильности ферментов и прогрессивную потерю активности. Именно здесь крылись причины тех разочарований, которые принесло использование метода адсорбции для очистки ферментов. Во-первых, адсорбционный метод оказался не столь избирательным, как это предполагалось сначала. Часть ферментов так и не удалось разделить. Но главный недостаток заключался в том, что при повышении степени очистки ферментного препарата нередко исчезало, притом внезапно в необъяснимо, то единственное свойство, по которому собственно и судили о присутствии фермента в препарате - его активность. [c.139]

В 1863 г. А. Я. Данилевский впервые разработал метод адсорбционного разделения и очистки ферментов поджелудочной железы. Этот метод нашел позже широкое применение в исследованиях Вильштеттера и его учеников по выделению ферментов и изучению их химии. [c.12]

К числу основных преимуществ метода адсорбционной иммобилизации следует отнести доступность и дешевизну сорбентов, выступающих в роли носителей, которым к тому же можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Не менее важным фактором является также простота применяемых методик. Кроме того, при адсорбционной иммобилизации нередко удается одновременно решить и проблему очистки фермента, поскольку связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. Действительно, многие из носителей для адсорбционной иммобилизации применяются также и при очистке ферментов. [c.56]

До настоящего времени аффинный сорбент не использовали повторно, но если разработать метод элюирования белка без фотолиза, так чтобы сорбент можно было снова использовать, то это откроет путь широкому применению этому адсорбционному методу для очистки В12-зависимых ферментов. [c.395]

Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофоб-ности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам. [c.3]

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Этот замечательный метод анализа, открытый русским естествоиспытателем М. С. Цветом (1903) нри исследовании растительных пигментов (хлорофилл и другие) и нашедший впоследствии широкое применение при исследовании, очистке и анализе таких сложнейших веществ, как витамины, гормоны, некоторые ферменты, естественные и синтетические пигменты, и т. п., предложен также для выделения ароматических углеводородов из смеси их с углеводородами других классов. Основания и техника адсорбционного анализа весьма просты и в применении к анализу углеводородных смесей заключаются в следующем [32]. [c.106]

Обычно считают нецелесообразным повторять фракционирование сульфатом аммония в одинаковых условиях несколько раз подряд. Но если варьировать температуру или pH, то порядок, в котором будут осаждаться различные белки, может измениться. В таком случае целесообразно проводить фракционирование последовательно, при разных условиях. Иногда для разделения системы используют различные соли последовательно или в виде смеси. Так, известен метод, в котором обезжиренную муку земляного ореха экстрагировали 10%-ным хлористым натрием при рН = —6,0, а затем из осветленного экстракта белки фракционировали с помощью сульфата аммония. Чтобы выделять отдельные ферменты, солевое разделение можно использовать и само по себе, и в комбинации с иными способами, с воздействиями, основанными на иных принципах. Сочетаются, например, высаливание, адсорбционные способы и электрофорез, спиртовое разделение фракций и затем их солевая очистка, дробное высаливание и электрофорез и т. п. [c.148]

Адсорбционные методы фракционирования и очистки ферментов, несомненно, имеют наибольшее будущее области их применения стремительно расщиряются. В качестве адсорбентов чаще всего используются гидроокись алюминия, гель трифосфата кальция, каолин, целлюлоза, крахмал, гидроокиси цинка, меди, магния, реже — бензойная кислота, древесный уголь и бентонит, применяемые обычно для удаления нежелательных примесей. [c.149]

Данилевский в 1863 г. впервые применил адсорбционный метод для очистки и разделения ферментов. [c.83]

В то же время начинается выдающаяся научная деятельность замечательного русского естествоиспытателя А. Я. Данилевского, которого по заслугам можно считать основоположником крупных биохимических исследований в России. Труды А. Я. Данилевского охватывают весьма раз-. личные области биохимии, но здесь естественно упор будет сделан на работы по белкам, исследованию которых ученый посвятил несколько десятилетий. Уже в своей докторской диссертации 24-летний (1863) А. Я. Данилевский [256] с успехом применил адсорбционный метод разделения и очистки ферментов поджелудочной железы. Подробная разработка этого современного способа изучения ферментов связана с исследованиями Виль-штеттера [257]. [c.262]

Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых разных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение таких методов часто позволяет получить наибольшую степень очистки белков, что в случае фе рментов означает максимально возможное повышение их удельной активности. Хотя колоночная хроматография служит идеальным способом оптимального разделения белков, не следует забывать и о методах адсорбции в объеме , так как это очень быстрые и потому весьма полезные методы, когда время имеет первостепенное значение (см. также гл. 7). Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (в виде геля или в кристаллической форме) и разнообразные аффинные адсорбенты, созданные для ферментов определенных типов. Все эти вопросы вслед за общим введением в теорию адсорбционной хроматографии обсуждаются в данной главе применительно к выделению белков. [c.91]

Важнейшим достижением Вильштеттера в препаративной химии ферментов было развитие им метода адсорбционной очистки соответствующих препаратов. Надо сказать, что этот метод бьш впервые применен З.Брюкке, а затем А.Я, Данилевским, а одновременно с Вильштеттером успешно разрабатывался Г.Зйлером с сотрудниками (см. ниже). Однако наиболее последовательно и успешно этот метод использовался Вильштеттером и его сотрудниками. Наиболее существенным в методе адсорбции было то, что с его помошью можно было отделить одну биокаталитическую активность от другой, один фермент от другого, даже если они находятся [c.136]

Очень перспективным методом очистки воды от всевозможных загрязняющих ее веществ, особенно синтетических, является использование иммобилизованных (закрепленных, нерастворимых) ферментов — ферментов второго поколения . Идея закрепления ферментов на нерастворимом в воде носителе и применения таких мощных катализаторов в технологических процессах и медицине возникла давно. Еще в 1916 г. осуществлена адсорбция инвертазы на активированном угле в свежевыделенной гидроокиси алюминия. С 1951 г. для фракционирования антител и выделения антигенов используют конъюгацию белков с целлюлозой. До недавнего времени существовал единственный метод закрепления ферментов — обыкновенная физическая адсорбция. Однако адсорбционная емкость известных материалов относительно белков явно недостаточна, а силы адгезии невелики, и разрыв связи между ферментом и поверхностью адсорбента может наступать от малейших изменений условий процесса. Поэтому такой метод иммобилизации не нашел широкого применения, но, поскольку он прост и может, по-видимому, способствовать выяснению механизма действия ферментов в живых системах, илах и почве, а в некоторых случаях применяться на практике, некоторые исследователи занимаются изучением адсорбции ферментов, поиском новых, эффективных носителей и т. д. [104, 206]. [c.176]

После выделения и операций предварительной очистки ферменты фракционируют и получают высокоочищенные препараты. Наиболее распространенными способами более высокой очистки являются фракционирование действием органических растворителей, нейтральных солей, при помощи адсорбционных методов, ионообменной хромотографии, очистка ферметных белков кристаллизацией. Менее употребительны — фракционирование с помощью ионов тяжелых металлов, гельфильтрации, электрофореза, а также некоторые другие способы. [c.145]

Первое применение) адсорбции для разделения и очистки ферментов было осуществлено русским биохимиком А. Я. Данилевским в 1862 г. С помощью свежеосажденного коллодия, использованного в качестве адсорбента, он отделил в панкреатическом соке амилазу от трипсина. Однако эта работа не давала общего метода анализа, который можно было бы применять для тонкого разделения сложных смесей. Такой общий адсорбционный метод анализа бьш впервые разработан М. С. Цветом. В основу метода М. С. Цвет положил избирательность адсорбции, т. е. способность разных веществ удерживаться на поверхности адсорбента при одинаковых условиях с разной интенсивностью. Он писал Для того, чтобы два находящихся в растворе вещества могли быть разъединены адсорбционным методом, необходимо, чтобы они занимали неодинаковый ранг в адсорбционном ряду , иначе говоря, имели бы разные коэффициенты адсорбции. М. С. Цвет обнаружил, что при фильтрации раствора растительк-ых пигментов через колонку с адсорбентом пигменты располагаются по длине колонки в виде отдельных зон. Исходя из этого, он сделал вывод, что зональное распределение составных частей раствора выражает относительное положение последних в адсорбционном ряду . Даже разница в таких свойствах двух веществ, как, например, молекулярная масса. [c.5]

Вильштеттером было опробовано и использовано для очистки ферментных препаратов большое число адсорбентов (около 40 вешеств), среди которых наилучшие результаты получены на угле, гидратах окиси алюминия и каолине. Вильштеттер приступил к исследованию возможности очистки ферментов методом адсорбции после того, как познакомился с работами Л.Михаэлиса и М.Эренрайха (80), опубликованными в 1908 г. и посвященными попыткам разработать адсорбционный метод очистки ферментов и дать ему физическое объяснение. Они полагали, что этот процесс связан с различием зарядов фермента и адсорбента. [c.137]

Описанный метод получил дальнейшее развитие, и на его основе был разработан прием аффинной хроматографии [122], который сводится к тому, что в буферный раствор добавляют лиганд, изменяющий адсорбционные характеристики. Будь то гидрофобные адсорбенты или агароза, принципы аффинной хроматографии остаются теми же, что и в случае использования более специфических адсорбентов (разд. 4.5) или ионообменников (разд. 4.4). Сначала в отсутствие лиганда находят условия, которых еще не вполне достаточно, чтобы вызвать нужный эффект (в данном случае элюцию). Затем добавляют лиганд, что слегка нарушает установившееся равновесие и приводит к ожидаемому эффекту. Важно, чтобы при добавлении лиганда происходило заметное изменение существенного для очистки свойства, в данном случае — гидрофобного взаимодействия. Лиганд должен сохранять способность связываться с ферментом в условиях, существующих в колонке, т. е. при высокой концентрации соли. Примером аффинного осаждения может служить очистка некоторых тРНК-аминотрансфераз [122] связывание крупной молекулы тРНК приводит к заметному снижению адсорбционной способности колонки, что позволяет осуществлять элюирование. [c.187]

Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше —10° С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод вьщеления и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит. электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Oiona из остроумнейших модификаций адсорбционного метода—аффинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый фермент элюируют с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтапную (аффинная сорбция—элюция) схему выделения. [c.97]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология