Релаксационные методы Релаксационный фермент

Скорость реакции, катализируемой ферментом, как правило, оказывается прямо пропорциональной концентрации фермента. Если изменять концентрацию субстрата, то обычно при низких его концентрациях реакция имеет первый порядок по субстрату, а по мере увеличения концентрации субстрата порядок реакции приближается к нулевому (рис. 10.10,а). Фактически измеряемые скорости суммарной реакции являются скоростями, относящимися к стационарному течению реакции. Когда смешиваются растворы фермента и субстрата, вначале происходит очень быстрая реакция фермента с субстратом, скорость которой можно измерить только с помощью специальных методов (например, релаксационных методов, разд. 10.2). Механизм стационарной реакции можно понять, если рассмотреть следующую простейшую схему реакции, описываемой суммарным уравнением 5 = Р [c.320]

Еще более быстрыми являются релаксационные методы, развитые преимущественно в работах Эйгена [14] с соавторами, которые позволяют измерять реакции, подобные переносу протона, с константами скоростей порядка 10 ° л-моль -с- . Эти методы сводятся к наблюдению за возвращением системы к равновесию (релаксации) после внезапного возмущения они ограничены в основном быстротой возмущения системы. Использование ЯМР [15] и метода температурного скачка позволяет достичь области временной постоянной порядка 10 с. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) — еще более быстрый метод (10 с), но требует, как правило, специального введения спиновой метки в фермент или субстрат. [c.455]

Как было отмечено выше, релаксационные методы использовались при исследовании ряда ферментативных реакций. Итоги этих исследований позволяют сделать два важных обобщения. Во-первых, константы скорости очень многих реакций образования фермент- [c.188]

Изучение кинетики нескольких механизмов реакций в ферментативном катализе. При изучении кинетики превращения субстрата 8 в продукт Р, катализируемого ферментом Е, установлено, что этот тип реакций обычно протекает очень быстро, поэтому часто вынуждены прибегать к релаксационным методам, чтобы определить константы скорости. В дальнейшем будут использованы следующие обозначения, представленные в табл. 8.1. [c.263]

Методы релаксационной кинетики в современном виде -мощное оружие в исследовании многостадийных фермент-субстратных реакций. Ниже анализируется кинетика реакции с участием п промежуточных соединений [c.177]

Все перечисленные в 2.1—2.3 механизмы ферментативных реакций основаны не только на теоретических уравнениях, но и на экспериментальном изучении этих реакций. Поэтому 2.4-2.5 посвящены специфическим методам изучения ферментативных реакций. Специфика данных методов заключается в потенциальной возможности определения числа промежуточных соединений в механизме ферментативного катализа. В 2.4 приведены нестационарные методы ферментной кинетики. Показано, что методы нестационарной кинетики позволяют определить число промежуточных соединений в ферментом катализе. В данном параграфе также описаны методы определения кинетических параметров ферментативных реакций с помощью нестационарной кинетики. В 2.5 освещены методы релаксационной кинетики, имеющие большое значение в изучении, в частности, механизмов химических реакций. Релаксационные методы основаны на изучении закономерностей протекания ферментативных реакций после быстрого выведения этих реакций из состояния равновесия. [c.332]

Поскольку равновесие гидролиза циклического фосфата до 3 -фосфата сильно сдвинуто вправо, равновесная смесь нуклеотидов и фермента содержит главным образом свободный и связанный 3 -фосфат. Так как циклический фосфат присутствует в очень малых количествах, релаксационные эффекты, связанные с его взаимодействием с ферментом, нельзя обнаружить в равновесной смеси. Выход из создавшегося положения был найден при использовании комбинации методов остановленной струи и температурного скачка, когда фермент и циклический фосфат быстро смешивали и затем скачкообразно повышали температуру системы. При такой постановке эксперимента возмущение системы производилось до установления равновесия и были зарегистрированы отдельные релаксационные процессы, связанные с взаимодействиями циклического фосфата и фермента. Аналогичные исследования проводили и со смесью фермента и цитидин-3 -фосфата. [c.73]

Были разработаны методы для изучения очень быстрых переходных процессов, хотя трудности, связанные с решением уравнений скорости, иногда мешают анализу таких систем. Однако, даже если нельзя решить уравнения скорости, в случае многих кинетических систем решение можно найти для условий, близких к равновесным. Это делают линеаризацией уравнений скорости, что приводит к системе линейных дифференциальных уравнений, которую можно решить стандартными методами. Для исследования быстрых процессов вблизи равновесия можно использовать релаксационную спектрометрию, регистрируя кинетику перехода химических форм системы к новому положению равновесия. Такой подход привел к пониманию деталей многих процессов. При изучении спектров времен релаксации ферментативных реакций было обнаружено, что связывание субстрата (лиганда) с ферментом происходит с частотой на 1—2 порядка ниже предельной величины, соответствующей случаю диффузионного контроля. Кроме того, обнаружены конформационные изменения молекулы белка, время протекания которых составляет от 10- до Ют с. [c.82]

Дальнейшее развитие изящных релаксационных методов представляет большой интерес. Путем сочетания метода остановленного потока и метода температурного скачка [16, 17] уже удалось получить весьма важную новую информацию о механизме действия ри-бонуклеазы, позволившую сформулировать представление о деталях процесса, катализируемого этим ферментом [17]. Сочетание этих двух методов применимо в тех случаях, когда положение равновесия изучаемой суммарной реакции таково, что равновесный фермент-субстратный комплекс, лимитирующий весь процесс, содержит лишь один из реагентов. Для изучения комплексов с другими реагентами фермент и исследуемый реагент смешивают в быстром потоке, который останавливают в ячейке для температурного скачка. После этого проводят исследование релаксационным методом в тот период времени, когда реакция еще не достигла такой степени, что прочно связанный продукт накапливается в количестве, мешающем измерению. [c.189]

Рибонуклеаза. При кинетическом исследовании ри-бонуклеазы релаксационным методом Като и Хаммес [17] изучили температурную зависимость бимолекулярных и мономолекулярных процессов, относящихся к связыванию цитидин-3 -фос1фата ферментом. Бимолекулярный процесс, сам по себе являющийся реакцией комплек-сообразования, характеризуется очень большой константой скорости, приближающейся к величине, характерной для реакций, скорость которых лимитируется диффу- [c.203]

При изучении ферментативных реакций кинетические исследования проводят, как правило, в условиях, при которых свободный фермент и его промежуточные формы находятся в стационарном состоянии. Это позволяет значительно упростить уравнения для скорости реакций, но приводит к потере значительной части информации о механизме процесса и промежуточных формах фермента. Поэтому более тонкие кинетические исследования включают определение предстацнонарных характеристик системы. Этот подход более сложен технически, и к тому же при его использовании требуется трудоемкий математический анализ кинетических кривых. Исследования предстационарной кинетики значительно упрощают релаксационные методы, которые стали очень популярны в последние годы. [c.41]

Назовите основные методы релаксационной кинетики. 2. Напишите уравнения релаксационной кинетики комплексообразования фермента с субстратом для случая одного промежуточного соединения, нескольких промежуточных соединений. 3. Какие экспериментальные методы релаксационной кинетики вы знаете 4. Что такое спектр времени релаксации 5. Как время релаксации связано с кинетическими константами скоростей элементарных стадий 6. Каковы кинетические схемы катализа аспартатаминотрансферазой и рибонуклеазой [c.185]

Химическая релаксация при комплексообразовании фермента с субстратом или эффектором (172). Кинетика комплексообразования с одним промежуточным соединением (174). Релаксационная кинетика многостадийной фермент-субстратной реакции (177). Экспериментальные методы исследования релаксационной кинетики (178). Аспартатаминотрансфераза, рибонуклеаза (181). [c.710]

Рассмотрим два примера. Первый пример — исследование связывания лиганда ферментом в ходе иекатализируемой реакции. При этом могут произойти два физических события связывание и индуцируемое лигандом конформационное изменение фермента. Чтобы установить число промежуточных стадий и определить соответствующие им константы скорости, прежде всего необходимо определить число времен релаксации и найти их концентрационную зависимость. В идеальном случае число времен релаксации будет равно числу стадий данной реакции. Если найдено даже одно время релаксации и его концентрационная зависимость нелинейна, это может означать, что процесс протекает в две стадии [например, уравнения (4.71) и (4.74)], Далее стоит воспользоваться несколькими физическими методами (например, исследовать флуоресценцию и поглощение лиганда и белка), поскольку некоторые стадии могут быть выявлены только с помощью одного из этих методов. В ходе рассматриваемой реакции могут протекать и другие физические процессы, например отдача или присоединение протона или изменение степени агрегации белка. В первом случае весьма полезен еще один метод — измерение pH, для чего можно использовать просто цветные индикаторы. Агрегация осложняет кинетические исследования, однако ее можно обнаружить и количественно охарактеризовать, что также даст дополнительную информацию. Для исследования простых реакций релаксационные методы часто оказываются эффективнее струевых, поскольку позволяют изучать более быстрые процессы. Однако иногда метод остановленной струи более ценен, например, при исследовании процессов, слишком медленных, чтобы применять метод температурного скачка. Кроме того, некоторые эксперименты (такие, как исследование влияния сильных изменений pH) можно осуществить только в том случае, если использовать методы, включающие быстрое смешивание реагентов (хотя небольшого изменения pH можно добиться, применив метод темпера- [c.151]

Тщательное исследование рН-функций оказалось весьма ценным при изучении механизма действия гидролаз. Возможность изолировать индивидуальные кинетические стадии с помощью методов остановленного потока, стационарной кинетики и релаксационной техники позволила получить вполне четкие результаты. Наиболее определенные данные при использовании некоторых субстратов были получены для трипсина и химотрипсина [2,3]. Именно с помощью такого подхода впервые было уста-йовлено участие остатков гистидина в механизме действия химотрипсина на стадиях ацилирования и деацилирования. Некоторые данные стационарной кинетики привели к полезным выводам о механизме действия негидролитических ферментов. Можно думать, что этот метод анализа механизмов ферментативных реакций будет быстро развиваться. Группа Альберти [4] провела очень тщательное измерение величин р/С и энтальпии ионизации связывающих группировок фумаразы. Данные о [c.217]

Методы определения элементарных констант усложняются по мере усложнения механизма реакции. Для типичной обратимой двухстадийной реакции комплексообразования лиганда А с активным центром фермента данные релаксационной кинетики позволяют определить все четыре элементарные константы скорости процесса [c.174]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология